miR-146a多态性与非小细胞肺癌易感性的研究

应 伟，王兴远，江 波，周 伟*

(广安市人民医院肿瘤科，四川 广安 638000)

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，每年造成100多万人死亡[1]，85%的病例为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC是一种上皮细胞恶性肿瘤，又分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌[2]，究其病因主要有遗传和环境因素[3-4]，遗传因素中目前已经鉴定了一些NSCLC突变基因，如EGFR和KRAS[5-8]，但其确切的发病机制仍不清楚。近年来，随着基因组研究的不断发展，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与NSCLC的关系逐步被揭示[9]。包括微小RNA(miRNA)的SNP，miRNA属于非编码RNA，在转录后参与调节靶miRNA，可调节的基因多达人类基因的30%[10-12]。已有研究[13-14]发现一些miRNA与肺癌的风险和预后显著相关。Takamizawa等[15]报告let-7 miRNA的低表达促进肺癌的进展，而Hayashita等[16]发现miR-17-92上调可能降低肺癌风险。在遗传因素中miRNA SNP与肺癌的发生密切相关，可能是SNP可以改变miRNA的生物学功能，进而影响个体罹患癌症的风险[17-19]。为此本文通过对四川广安地区汉族人群miR-146a rs2910164 G/C基因多态性分析，探讨其与非小细胞肺癌遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集四川省广安市人民医院2016年3月—2018年3月收治入院的非小细胞肺癌患者，共采集198例患者的静脉血标本作为病例组。纳入标准：经病理学确诊为原发性NSCLC、未进行抗癌治疗、无肿瘤家族史，其中鳞癌81例、腺癌115例、腺鳞癌2例。排除标准：经检查排除肺部占位性病变、无痰中带血或血痰、胸痛等症状。对照组218例为同期医院体检的健康人群。

1.2 试剂与仪器

miR-146a引物和2×Taq PCR Master Mix(Qiagen生物科技有限公司)，标准酶试剂盒(英国RNADOX公司)，Gold View I型核酸染色剂(上海拜力生物科技有限公司)，Sac I-HF限制性核酸内切酶(Fermentas公司)，核酸提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)。DHG-9140A型鼓风干燥机(上海精宏实验设备有限公司)，S21-6电热恒温水浴箱(上海博讯仪器公司)，可调微量移液器(德国Eppendorf公司)，ChemiDoc XRC凝胶电泳成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 标本采集

采用真空抗凝(EDTA)管采集空腹静脉外周血3 mL，3 000 r/min离心10 min，收集血细胞，置于-80℃冷冻贮存、待检。

1.4 基因型分析

采用酚-氯仿抽提法对血液样本进行DNA提取，通过Nanodrop检测其浓度后用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术检测基因型，miR-146a rs2910164基因的引物上游为5'-CATGGGTTGTTGTGTCAGTGTCAG AGCT-3'，下游为5'-AACCTTCTGACCTCTGTCTTCCG T-3'，PCR反应体系10 μL中含模板 DNA 1 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 4 μL，去离子水4.6 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性34 min，94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，35个循环；72℃ 延伸5 min。用Sac I-HF酶对PCR产物进行酶切，并置于37℃恒温水浴4 h、取出进行电泳实验及染色。最后基因型由2位研究者进行判读，若判读结果不一致时，则重新检测1次。随机抽取10%的样本进行测序验证。

1.5 统计学方法

运用SPSS 20.0统计软件，计算基因型的频率及是否符合Hardy-Weinberg平衡。单因素及多因素Logistic回归分析，计数资料采用单因素χ2检验，计量资料采用t检验和比值比(OR)计算风险比例与95%可信区间(confidence intervals，CI)。均以双侧α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 研究对象一般资料

病例组和对照组在性别、年龄的分布差异无统计学意义(P>0.05)，吸烟在两组间的差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 对照组与病例组人群一般资料的比较

2.2 rs2910164酶切结果

rs2910164被酶切成 GG、GC、CC基因型(图1)，CC基因型为122和25 bp 2条带；GC基因型为147、122和25 bp 3条带；GG基因型为147 bp和25 bp 2条带；3种基因型中25 bp条带均未显示。

图1 rs2910164酶切后电泳图

2.3 rs2910164基因分型与测序

GG、GC、CC分型在对照组分别为103例(47.25%)、85例(38.99%)、30例(13.76%)；在病例组分别为 31 例(15.66%)、99 例(50.00%)、68 例(34.34%)。随机抽取10%的样本进行DNA测序，见图2。其结果与PCR-RFLP分型结果一致，基因分型频率满足Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)。

2.4 rs2910164基因型与非小细胞肺癌发病风险的关系

不同基因模型下的Logistic回归分析结果见表2。CC基因型显著增加非小细胞肺癌的发病风险[OR(95%CI)为7.26(6.69，7.87)]，差异具有统计学意义(P<0.01)，校正性别、年龄、吸烟因素后OR(95%CI)为6.82(6.28，7.41)，差异亦具有统计学意义(P<0.01)。显性基因模型中GC/CC可使非小细胞肺癌的患病风险增加5.14倍，校正混杂因素后OR(95%CI)为5.04(4.72，5.39)，差异具有统计学意义(P<0.01)。隐性基因模型中，CC基因型罹患非小细胞肺癌的风险是GG/GC基因型的2.94倍，校正性别、年龄、吸烟因素后差异仍有统计学意义(P<0.01)。等位基因模型中C等位基因明显增加人群罹患非小细胞肺癌的风险，OR(95%CI)为2.92(2.21，3.89)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图2 rs2910164基因测序结果

表2 rs2910164基因型与非小细胞肺癌风险的关系

2.5 rs2910164与非小细胞肺癌临床特征之间的关系

在病例组中，根据不同的肿瘤特征进行分组(表3)，采用Logistic回归分析显性基因模型与非小细胞肺癌临床特征的关系。通过校正吸烟、性别、年龄等因素，各个基因模型与非小细胞肺癌病理类型、临床分期、淋巴结转移之间无明显相关性，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 rs2910164与非小细胞肺癌临床特征之间的关系

2.6 基因-环境的交互分析

采用非条件Logistic回归“后退法”，在校正性别、年龄的前提下，将吸烟纳入回归模型。结果显示rs2910164 GC和CC基因型与吸烟之间无交互作用(β=-0.048，P=0.520；β=-0.145，P=0.088)。见表4。

表4 吸烟与基因型的交互作用

3 讨论

miR-146包括miR-146a、miR-146b，其中miR-146a位于人类5号染色体loc285628的外显子区域，具有较高的稳定性和保守性，并在转录后通过与靶基因集合参与多种生物学过程(包括免疫、炎症、肿瘤等)[20-21]。在参与肿瘤发生发展的过程中，可能是由于rs2910164 G到C等位基因的突变导致G∶U与C∶U之间的错配，使得成熟miR-146a的产生与表达受到影响[22]，含有C等位基因miR-146a前体的转录活性较低，最终影响miR-146a与靶mRNA的结合[23]，进而影响了个体罹患肿瘤的风险。

迄今为止，有关miR-146a rs2910164基因多态性在肿瘤发生风险中的研究较多，但存在诸多的不一致。例如，杂合子基因型GC可增加人群罹患甲状腺乳头状癌的风险[24]；Shen等[25]研究发现C等位基因可增加人群罹患家族性乳腺癌的风险；Xu等[26]发现CC基因型可降低罹患前列腺癌的风险；Jeon等[27]报道携带CG/GG基因型的个体与韩国人群中的CC基因型相比，肺癌发生风险明显降低。Xiao等[28]通过对6篇病例-对照研究进行Meta分析发现，miR-146a rs2910164 CC基因型与GG基因型相比可增加人群罹患肺癌的风险；Fang等[29]研究发现肺癌病例组中CC基因型、C等位基因较正常对照组中明显增多；Vinci等[30]发现rs2910164 GC基因型可显著增加非小细胞肺癌的发生风险。上述研究结果表明rs2910164基因多态性与肿瘤的易感性之间存在明显的差异性。本次研究表明，广安地区汉族人群miR-146a rs2910164基因多态性C等位基因可增加人群罹患非小细胞肺癌的风险，携带GC/CC基因型的个体患肺癌的危险性增加5.04倍。

研究[13-14]表明miRNA与肺癌的风险和预后显著相关，为进一步探讨rs2910164基因多态性与NSCLC临床特征之间的关系，本研究通过显性基因模型下的不同特征分析，并未发现rs2910164基因多态性与NSCLC的临床特征有关联。综上所述，本研究发现rs2910164 C等位基因可增加人群罹患NSCLC的风险，但由于SNP在不同种族、人群、生活环境等的差异，在未来仍需要进一步的大样本、多中心的研究加以验证。