胸苷酸合成酶免疫组化染色在标记前列腺基底细胞中的应用

郭 睿,田 怡,金雪媛,黄 莺,强 磊,黄小钟,杨 军

(西安交通大学第二附属医院病理科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:yangjundr@163.com)

前列腺癌(prostate cancer)是严重威胁老年男性的重要恶性肿瘤,其发病率呈现逐年上升且年轻化的明显趋势[1-3]。以HE染色切片为基础的病理诊断是前列腺肿瘤诊断和鉴别诊断的金标准。正常前列腺腺泡和导管黏膜存在两层细胞,外层基底细胞(basal cells,BC)的存在与否和分布状态是从病理形态学水平识别正常前列腺组织、诊断与鉴别诊断前列腺肿瘤的最关键的显微镜下指标之一[4]。如果腺泡和导管周围存在基底细胞则可排除浸润性前列腺癌的诊断。因此,能否准确识别基底细胞具有重要的临床诊断价值。但是,HE染色并不能准确显示前列腺腺泡周围的基底细胞。因而,采用免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)通过检测基底细胞特异性分子标志物(molecular marker)的表达来协助确认基底细胞成为前列腺癌诊断和鉴别诊断必不可少且最可靠的方法[5-8]。

目前,常用的基底细胞特异性标记物有P63、CK-H(抗体克隆号:34βE12)、CK5/6、CD10、SMA、S-100、Calponin等[7-9]。近来,作者在研究胸苷酸合成酶(thymidylate systhase, TS)与5-FU耐药中意外发现TS能特异性高表达于基底细胞胞核内,并由此首次提出TS可作为前列腺基底细胞的特异性分子标志物。因此,该研究拟采用免疫组化方法通过检测TS在不同类型前列腺病变中的表达,并与P63、CK-H等常用基底细胞特异性标志物相比较,评估TS作为前列腺基底细胞特异性分子标志物的特异性和敏感性,及其在前列腺癌诊断和鉴别诊断中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选取西安交通大学第二附属医院病理科2017-12～2018-11间前列腺粗针穿刺、经尿道前列腺电切术(TURP)和前列腺全切等方式获得的各种前列腺病变的存档样本108例,其中正常(其他病变切除样本中附带的前列腺组织和非肿瘤性前列腺病变周围组织)及前列腺增生样本27例、前列腺非典型上皮内瘤变(PIN)样本18例和前列腺腺癌样本63例。患者年龄37-58岁,平均52.3岁。

1.2 方法

所有样本离体后均迅速用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚连续切片,分别进行HE染色和IHC染色。由有资质的病理医生对所有样本的HE染色切片进行显微镜下观察和病理组织学诊断。IHC染色采用EnVision法分别检测P63、TS、CK-H及P504S抗原在所有样本中的表达,所有操作均按照全自动免疫组化仪Ventana Bench Mark XT(瑞士,罗氏)操作流程进行。EnVision免疫组化试剂盒购自罗氏公司(瑞士),抗-TS抗体(克隆号:TS106)购自广州安必平医药科技股份有限公司(中国),抗-P63抗体(克隆号:MX013)、抗-CK-H抗体(克隆号:34βE12)、抗-P504S抗体(克隆号:13H4)购自福州迈新生物技术开发有限公司(中国),按1 ∶100稀释。TS、P63、CK-H以正常前列腺组织作为阳性对照,以已知P504S阳性的前列腺癌样本为P504S阳性对照,PBS代替一抗作为阴性对照。按照前列腺肿瘤WHO诊断标准诊断[10]。

1.3 免疫组化染色结果判读

根据TS、P63、CK-H和P504S在前列腺样本不同细胞中的表达模式选择相应的判读方法[11],TS、P63或CK-H在前列腺基底细胞中不着色判读为阴性(-),呈不同阳性强度和百分比着色者判读为阳性(+);TS在前列腺腺上皮细胞、癌细胞、间质细胞胞质中不着色判读为阴性(-),呈不同阳性强度和百分比着色者判读为阳性(+);P504S在前列腺癌细胞中不着色判读为阴性(-),呈不同阳性强度和百分比着色者判读为阳性(+)。

1.4 统计学分析

应用列联表、Fisher精确概率法及SPSS 18.0统计软件比较TS、P63或CK-H在各组间表达的阳性率。计算TS识别基底细胞的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

TS与P63均以清晰的胞核型表达模式特异性强阳性表达于正常和增生前列腺组织、前列腺上皮内肿瘤及前列腺癌旁组织等所有样本的腺泡及导管基底细胞胞核中,但在腺泡细胞、癌细胞和间质细胞胞核中呈阴性表达;CK-H在前列腺基底细胞中则呈典型的胞质型强阳性表达。同时,P63、CK-H在所有样本的腺泡上皮细胞、癌细胞及间质细胞中均不表达。P504S在所有前列腺癌癌细胞和部分前列腺上皮内瘤变(PIN)组织的瘤细胞胞质中呈不同强度阳性表达,而在正常和增生前列腺、癌旁组织中呈阴性表达(见图1-3,表1)。

此外,TS除了可稳定表达于基底细胞胞核之外,TS在正常和增生前列腺腺泡细胞中呈阴性表达,在3例(16.7%)PIN样本腺泡细胞中呈弱阳性表达,在25例(39.7%)前列腺癌样本的癌细胞胞质中呈不同强度阳性表达。同时,在前列腺上皮内肿瘤细胞巢周围可见不连续分布的TS、P63、CK-H阳性基底细胞,而在前列腺癌癌巢周围缺乏TS、P63、CK-H表达阳性的基底细胞(见图1-3,表1)。

A,F.HE染色的前列腺组织;B,G.P63在前列腺组织基底细胞胞核中呈强阳性表达;C,H.TS在前列腺组织基底细胞胞核中呈强阳性表达;D,I.CK-H在前列腺组织基底细胞胞质中呈强阳性表达;E,J.P504S在前列腺腺上皮细胞胞质中呈阴性表达图1 P63、TS、CK-H、P504S蛋白在正常前列腺组织样本中的表达 (HE和免疫组化染色)Figure 1 Expression of P63,TS,CK-H,P504S proteins in normal prostatic tissue (HE and EnVision)

A,F.HE染色的前列腺上皮内瘤变(PIN)组织;B,G.P63在PIN基底细胞胞核中阳性表达,基底细胞呈不连续性分布;C,H.TS在PIN基底细胞胞核中阳性表达,基底细胞呈不连续性分布;D,I.CK-H在PIN基底细胞胞质中阳性表达,基底细胞分布不连续;E,J.P504S在PIN瘤细胞胞质中呈阴性表达图2 P63、TS、CK-H、P504S蛋白在前列腺上皮内瘤变(PIN)样本中的表达 (HE和EnVision)Figure 2 Expression of P63,TS,CK-H,P504S proteins in PIN (HE and EnVision)

2.2 TS的敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值

统计学分析结果显示,P63在27例正常和增生前列腺基底细胞、18例PIN基底细胞、63例前列腺癌基底细胞中核100%阳性表达,TS与P63表达结果相同,也呈核100%阳性表达。CK-H在27例正常和增生前列腺基底细胞、18例PIN基底细胞、63例前列腺癌基底细胞胞质中阳性表达率均为88.9%,P63基底细胞胞核中表达率均为100%。以上结果表明,TS在前列腺基底细胞中的表达与P63和CK-H具有高度一致性(Kappa≥0.75,见表2,3),且TS作为前列腺基底细胞分子标志的特异性和敏感性均高达100%(见表4)。

A,F.HE染色的前列腺腺癌组织;B,G.P63在前列腺腺癌癌旁前列腺基底细胞胞核中呈强阳性表达,癌巢周围缺乏P63阳性基底细胞;C,H.TS在前列腺腺癌癌旁前列腺基底细胞胞核中呈强阳性表达,癌巢周围缺乏TS阳性基底细胞;D,I.CK-H在前列腺腺癌癌旁前列腺基底细胞胞质中呈强阳性表达,癌组织中缺乏CK-H阳性基底细胞;E,J.P504S在前列腺腺癌细胞胞质中强阳性表达,周围前列腺腺泡细胞呈阴性表达图3 P63、TS、CK-H、P504S蛋白在前列腺腺癌组织样本中的表达 (HE和EnVision)Figure 3 Expression of P63,TS,CK-H,P504S protein in prostate carcinoma (HE and EnVision)

表1 TS、P63、CK-H在前列腺病变样本中的表达例(%)

Table 1 Expression of TS,P63,CK-H proteins in prostatic lesion specimenscases(%)

组别正常和增生前列腺(n=27)PIN(n=18)前列腺腺癌(n=63)基底细胞腺泡上皮细胞基底细胞腺泡上皮细胞癌旁组织基底细胞癌细胞P63 阳性27(100.0)0(0.0) 18(100.0)0(0.0) 63(100.0)0(0.0) 阴性0(0.0) 27(100.0)0(0.0) 18(100.0)0(0.0) 63(100.0)TS 阳性27(100.0)0(0.0) 18(100.0)3(16.7)63(100.0)25(39.7) 阴性0(0.0) 27(100.0)0(0.0) 15(83.3) 0(0.0) 38(60.3) CK-H 阳性24(88.9) 0(0.0) 16(88.9) 0(0.0) 56(88.9) 0(0.0) 阴性3(11.1)27(100.0)2(11.1)18(100.0)7(11.1)63(100.0)

表2 TS与P63在前列腺病变样本一致性检验例(%)

Table 2 Consistency test of TS and P63 in prostatic lesion specimenscases(%)

样本 nP63TS阳性阴性阳性阴性Kappa值正常和增生前列腺组织基底细胞2727(100.0)0(0.0)27(100.0)0(0.0)≈1PIN基底细胞1818(100.0)0(0.0)18(100.0)0(0.0)≈1前列腺腺癌癌旁组织基底细胞6363(100.0)0(0.0)63(100.0)0(0.0)≈1

表3 TS与CK-H在前列腺病变样本一致性检验例(%)

Table 3 Consistency test of TS and CK-H in prostatic lesion specimenscases(%)

样本 nTSCK-H阳性阴性阳性阴性Kappa值正常和增生前列腺组织基底细胞2727(100.0)0(0.0)24(88.9)3(11.1)≈1PIN基底细胞1818(100.0)0(0.0)16(88.9)2(11.1)≈1前列腺腺癌癌旁组织基底细胞6363(100.0)0(0.0)56(88.9)7(11.1)≈1

表4 TS、P63、CK-H作为基底细胞标志的敏感性、特异性及阳性、阴性预测值(%)

Table 4 Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of TS, P63 and CK-H as basal cell markers(%)

组别nP63TSCK-H敏感性特异性阳性预测值阴性预测值敏感性特异性阳性预测值阴性预测值敏感性特异性阳性预测值阴性预测值正常和增生前列腺2710010010010010010010010088.810010090PIN1810010010010010010010010088.910090100前列腺腺癌6310010010010010010010010088.910010090合计10010010010010010010010088.910096.793.3

3 讨论

前列腺癌是来源于前列腺腺泡上皮细胞的恶性肿瘤[12,13]。在显微镜下识别、判定前列腺基底细胞的存在与否及分布是前列腺癌病理诊断和鉴别诊断最重要的组织形态学依据之一。但是,常规HE染色并非总能满意显示基底细胞的存在和分布状态,尤其是在前列腺穿刺样本病理诊断中,由于样本较小,而且穿刺取材造成的细胞挤压常使得基底细胞在HE染色切片更难以辨认。因此,采用免疫组化染色检测基底细胞的存在与否及其分布成为前列腺癌的诊断和鉴别诊断的重要手段。目前,常用的前列腺基底细胞特异性免疫组织化学标志物有CK5/6、P63、CD10、CK-H等10余种[14-17]。

TS是嘧啶核苷酸合成的关键酶,在肿瘤细胞中,TS通过与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)代谢物FdUMP和5,10亚基四氢叶酸(5,10-CH2FH4)结合形成TS-FdUMP-CH2FH4复合物,从而抑制5-FU的疗效[18-20]。现已证实TS在多种肿瘤(如胃癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌等)细胞胞质中呈不同程度的高表达,并由此导致肿瘤对5-FU的耐药[21-24]。且TS在肿瘤细胞胞质中的表达水平与肿瘤细胞对5-FU的耐药性呈正相关,因而,TS已作为评估肿瘤对5-FU耐药的分子靶标而被广泛用于临床。

近来,作者惊奇地发现,TS不仅可表达于前列腺癌癌细胞胞质中,还可特异性表达于基底细胞胞核中。这一发现此前并未见报道。因此,作者首次提出TS可作为一种新的前列腺基底细胞的特异性分子标志物。为此,该研究采用免疫组织化学染色检测TS及P63、CK-H和P504S在不同类型前列腺病变中的表达[25,26],分析TS作为前列腺基底细胞分子标志的敏感性、特异性及临床应用价值。

结果证实,TS不仅在前列腺癌样本(39.7%)癌细胞胞质中呈不同阳性强度的特异性表达,可作为5-FU耐药及预后的分子靶标,TS还可特异性表达于所有样本的前列腺基底细胞胞核中。而且,TS与P63在基底细胞中的表达模式完全一致。统计学分析发现,TS在前列腺基底细胞中表达与P63、CK-H等基底细胞分子标志的阳性表达率高度一致(P>0.05),且其作为前列腺基底细胞分子标志物的特异性、敏感性和阳性预测值、阴性预测值甚至均可高达100%。

由此可见,TS不仅可作为5-FU耐药的分子标志物,还可作为前列腺基底细胞的分子标志物,因而可作为双功能分子标志物用于前列腺癌的诊断、鉴别诊断及对5-FU耐药性的评估。这也是迄今为止已知的所有前列腺基底细胞分子标志所不具备的特征。

此外,虽然TS可以胞质型模式表达于前列腺腺泡细胞、癌细胞、间质细胞胞质中,但并不在上述细胞胞核中表达。显然,这与TS在基底细胞中呈典型的胞核型高表达具有显著的特征性差异,因而并不会对正确判读造成困扰或带来任何困难。再者,TS在基底细胞中呈典型胞核型表达,使其具有可清晰、明确计数的特征。因而,采用TS作为基底细胞特异性分子标志明显优于CK-H等胞质型基底细胞分子标志。

总之,该研究首次发现TS不仅可作为评估前列腺癌对5-FU耐药性的分子靶标,还作为一种新的前列腺基底细胞特异性的分子标志而用于前列腺癌的诊断和鉴别诊断,因而,与传统前列腺基底细胞分子标志相比较,TS具有双功能分子标志的特征和明显优势。但是,截至目前,对于TS在前列腺基底细胞中特异性表达的分子机制和功能尚不清楚,因此,未来应对此进行深入的研究。