螯合剂辅助乙醇提取猕猴桃皮黄酮的工艺优化

伊莉，赵处敏，冯翠萍，王晓闻，吴锁柱，延莎

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

猕猴桃是我国种植量非常大的一种水果，大多数的省份都有种植。猕猴桃广受喜爱，很重要的一个原因就是其果实中含有大量的抗衰老物质，可以有效的清除人体内的自由基[1-3]。除此之外，猕猴桃皮中也含有黄酮等功能活性物质，可以加以利用。但大多数企业为了追求效益，也限制于生产加工工艺和技术的落后，大多将猕猴桃皮丢弃，或加工成动物饲料，造成了极大的浪费。

黄酮类物质为存在于自然界中对人体有诸多益处的一类植物源化合物，多见于果蔬、茶、葡萄酒等食品中，黄酮类化合物越来越成为了药理学和营养保健食品学的研究重点，它所具有的抗癌，抗氧化等作用已经在科学研究中发挥出巨大的作用，特别是在心脑血管方面，增加类黄酮摄入，可以降低患冠状动脉心脏病的危险[4-7]。对于植物资源中黄酮类物质的提取，常用的有热水提取法和醇提法，热水浸提法虽然成本低，但是用时较长；醇提法是分离黄酮类物质最常用的方法，提取效率高，操作简便[8-12]。猕猴桃皮中含有大量的钙、铁等微量元素，这些矿物质元素易与有机大分子物质螯合降低提取率。在提取同时加入螯合剂，可以与金属离子络合为金属络合物，通过竞争金属离子游离出有机大分子[13-15]。本试验采用螯合剂六偏磷酸钠辅助乙醇溶剂浸提猕猴桃皮中的黄酮类物质，对提取工艺进行优化，确定提取猕猴桃皮中黄酮类物质的最佳工艺条件，为提升猕猴桃皮的附加值提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

猕猴桃：市售；无水乙醇，硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、六偏磷酸钠等均为分析纯：国药集团化学试剂公司；芦丁标准品（UV≥98%）：上海圻明生物科技有限公司。

1.2 仪器和设备

101-2 型电热恒温鼓风干制箱：上海精宏实验设备有限公司；UV-1200 型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；JY-15A 型多功能粉碎机：江业制造有限公司；HH4 型恒温水浴锅：常州澳华试验设备公司；TD5G 台式低速离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

精选七到八分熟的新鲜猕猴桃，洗净，取果皮切成1 cm×1 cm 的小块，放入60℃鼓风干燥箱内，待干燥后进行粉碎，过60 目筛，得到猕猴桃皮粉末备用。

1.3.2 黄酮得率的计算

采用 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 光度法检测黄酮含量，用芦丁标准品参考文献[3]的方法绘制标准曲线。猕猴桃皮黄酮的得率按式（1）计算。

式中：X 为依据标准曲线计算所得的黄酮含量，mg/g；N 为猕猴桃皮粉原液稀释倍数，V 为原液体积，mL；M 为样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

精确称取猕猴桃皮粉5 g，按照不同的料液比加入一定浓度的乙醇溶剂，同时按照不同比例加入螯合剂六偏磷酸钠，置于不同温度的恒温水浴中提取一定时间，3 600 r/min 条件下离心10 min，取上清液。重复提取2 次，合并上清液。在波长505 nm 处比色，根据1.3.2 的方法计算黄酮得率。各水平的选择详见表1。

1.3.4 正交试验

在单因素试验结束后，通过对结果的分析，从5个因素中选择4个对猕猴桃皮黄酮得率影响较大的因素，进行正交试验，确定最优工艺。

表1 单因素试验水平选择Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

试验得到芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

由图1可知，标准曲线回归方程为y=12.228x+0.004 8，R2=0.999 7，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比的单因素试验结果

料液比的单因素试验结果如图2所示。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 The effect of liquid-solid ratio on flavonoids extraction ratio

从图2中可观察到，当料液比为 1∶20（g/mL）时，黄酮得率最高，达到1.032%。料液比在1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）范围内时，猕猴桃皮黄酮的得率并没有随之增大。综合考虑成本因素，选取1∶20（g/mL）为最适合的料液比。

2.2.2 提取时间的单因素试验结果

提取时间的单因素试验结果如图3所示。

图3 提取时间对提取效果的影响Fig.3 The effect of time on flavonoids extraction ratio

从图3中可观察到，提取时间越长，黄酮得率也在逐渐升高，当提取时间达到70 min 时达到最高，此时黄酮得率为1.161%。随着提取时间继续延长，猕猴桃皮黄酮的得率基本保持不变。因此，选取最适合的提取时间为70 min。

2.2.3 提取温度对黄酮得率的影响

提取温度对猕猴桃皮黄酮得率的影响结果如图4所示。

图4 提取温度对提取效果的影响Fig.4 The effect of temperature on flavonoids extraction ratio

由图可知，在50℃～80℃范围内，提高提取温度，黄酮得率逐渐提高。当达到80℃时，得率达到最高，为1.341%。当温度高于80℃以上继续升高时，黄酮得率不但没有升高，反而有所下降。可能的原因是高温导致黄酮物质的结构破坏而影响了提取效果，因此选取最合适的温度为80℃。

2.2.4 乙醇浓度的单因素试验结果

乙醇浓度的单因素试验结果如图5所示。

由图5 分析可得，乙醇浓度越高，得率逐渐提高。当乙醇浓度达到70%时，得率达到最高，为1.356%。在高于70%时，提高乙醇浓度，猕猴桃皮黄酮的得率并没有继续升高，反而略有下降。可能的原因为由于提取液中除黄酮外的其他物质随着乙醇浓度的升高，溶解度升高，提取量也随之加大，阻碍了黄酮的提取。因此选取最合适的乙醇浓度为70%。

图5 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.5 The effect of ethanol concentration on flavonoids extraction ratio

2.2.5 螯合剂六偏磷酸钠添加量的单因素试验结果

螯合剂六偏磷酸钠的添加量的单因素试验结果如图6所示。

图6 螯合剂添加量对提取效果的影响Fig.6 The effect of chelating agent on flavonoids extraction ratio

从图6中可以看出，在一定范围内，六偏磷酸钠添加量越高，猕猴桃皮黄酮的得率逐渐升高。当螯合剂的添加量达到0.5%时，猕猴桃皮黄酮的得率最高，为1.485%。当螯合剂添加量高于0.5%时，随着螯合剂添加量的提高，猕猴桃皮黄酮的得率不但没有提高，反而有所下降，可能是因为随着螯合剂添加量的增加，与样液中的水分相结合，使样液的极性在提取时发生变化，最后造成了提取效果不明显，降低了黄酮的提取量。因此选取最合适的螯合剂添加量为0.5%。

2.3 正交试验结果

在单因素试验结果基础上，选取对猕猴桃皮黄酮得率影响较大的提取时间、提取温度、乙醇浓度、螯合剂（-SH）六偏磷酸钠添加量等4个因素，进行四因素三水平的正交试验，优化螯合剂辅助乙醇浸提猕猴桃皮中黄酮的工艺参数，选择料液比1∶20（g/mL），因素水平表见表2。

正交试验结果如表3所示。

结果表明，在试验4中猕猴桃皮中黄酮的得率最高，即A2B1C2D3，此时的猕猴桃皮黄酮得率为1.518%。从极值大小可以看出4种因素对试验结果影响的效果为C（提取时间）〉A（提取温度）〉B（乙醇浓度）〉D（螯合剂六偏磷酸钠添加量）。对正交试验结果分析可知，最优水平组合为A2B1C2D3，与通过正交试验结果表中最优水平组合试验4 相同，所以最优工艺参数提取时间70 min，提取温度80℃，乙醇浓度60%，螯合剂六偏磷酸钠添加量0.6%。此时猕猴桃皮中黄酮的得率为1.518%。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

表3 正交试验优化结果Table 3 The results of orthogonal experiment

3 结论与讨论

在猕猴桃皮黄酮提取的试验中，结果显示添加含巯基（-SH）的螯合剂六偏磷酸钠，可以明显的提高黄酮的提取效果。通过单因素试验和正交试验，最终确定猕猴桃皮中黄酮的最佳提取条件为：料液比1∶20（g/mL），提取时间 70 min，提取温度 80℃，乙醇浓度60%，螯合剂六偏磷酸钠添加量0.6%。此时黄酮得率达到1.518%。

含巯基（-SH）的螯合剂选择了六偏磷酸钠，食品级六偏磷酸钠应用在多种食品中，如腌制肉、水果饮料、冰激凌和乳制品等。由于在提取黄酮时，螯合剂的使用量很小，在安全用量范围内，因此可以利用六偏磷酸钠辅助提取黄酮，为今后猕猴桃皮的综合利用提供理论依据。