贯筋藤多糖的提取及其单糖组分分析

施娅楠，谢文祥，陶亮，黄艾祥

（云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

贯筋藤（Dregea sinensis Hemsl.）[1]，为萝藦科（Asclepiadaceae） 南山藤属（Dregea E.Mey.，nom.cons.）植物，俗称“奶浆藤”，生长于海拔2 000 m～3 000 m 山地森林中或山地林谷沟旁，主产于云南巍山、剑川、昆明，贵州等地，资源丰富，当地百姓利用风干贯筋藤水溶液作为凝乳剂生产民族食品乳饼，乳扇。黄艾祥等[2-6]对贯筋藤天然植物凝乳剂、蛋白酶，贯筋藤花营养成分、安全性进行了系列研究，中科院昆明植物研究所对贯筋藤中的小分子活性物质进行了分离鉴定[7-9]，关于贯筋藤多糖的研究未见相关报道。

根据《云南植物志》记载“贯筋藤全株药用，防龋齿，止泻抑菌，耐缺氧抗疲劳，对癫痫疾患有较好的疗效”，是一种重要的药用和食用资源[10]，目前大量的贯筋藤茎杆提取凝乳剂后直接丢弃，造成大量资源浪费，如茎秆中多糖，有机酸，萜类和黄酮等活性成分[8-9]。随着多种真菌多糖、植物多糖被成功的开发和利用，如食用菇多糖、茯苓多糖、海藻多糖、铁皮石斛多糖、金针菇多糖等[11-16]，多糖大量的活性功能也相继报道，如调节机体免疫力、抗炎、抗氧化、降血糖及抗菌等有益生理活性以及极低的毒副作用[17-18]。本研究以贯筋藤的高值化利用出发，进一步提取多糖，并采用乙酸酐乙酰化衍生法对贯筋藤茎杆多糖中单糖组份进行定性研究，为云南地方资源的开发以及贯筋藤进一步活性功能的挖掘提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

贯筋藤鲜茎：采自云南大理州剑川县，海拔2 000m～3 000 m 山地森林或灌木丛；标准单糖：Merck 公司；Beyotime 蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975c 气质联用仪：美国Agilent 公司；SpectraMax M5x 酶 标 仪 ：Molecular Devices 公 司 ；ProUV-1700 紫外可见光谱仪：日本岛津公司；FD-1A-50 真空冷冻干燥机：上海比朗仪器有限公司；TDL-5-A 离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；78-2 型磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；Megafug e1.0R 型高速冷冻离心机：丹麦Heto 公司。

1.3 试验设计

1.3.1 贯筋藤多糖样品制备

贯筋藤茎秆取洗净去杂物，敲碎浸提，过滤后减压浓缩至原体积的四分之一，加入80%乙醇，醇沉24 h 后离心，沉淀用无水乙醇洗涤3 次，后水浴加热，除去乙醇，弱碱性树脂DEAE 纤维素脱色，三氯乙酸脱蛋白，透析、离心，最后用丙酮洗涤2 次，真空冷冻干燥得贯筋藤多糖。

1.3.2 单因素试验

分别设置贯筋藤鲜茎料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]，浸提温度（50、60、70、80、90℃），浸提时间（20、40、60、80、100 min），以多糖得率为指标，研究各因素变量对贯筋藤茎杆中多糖提取率的影响。

1.3.3 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选择料液比（A）、浸提时间（B）、浸提温度（C）为考虑因素，以贯筋藤粗多糖得率为参考指标，采用L9（34）正交表进行正交试验，确定最佳提取工艺，各因素水平见表1。

表1 贯筋藤多糖提取工艺的正交试验方案Table 1 Factor and levels for orthogonal experiment on extraction of polysaccharide from Dregea sinensis Hemsl.

2 检测指标

2.1 贯筋藤理化分析

贯筋藤多糖得率/%=（多糖干品质量/原料质量）×100；苯酚-硫酸法测定总糖含量[19]；硫酸基含量采用硫酸钡比浊法[20]；贯筋藤蛋白含量测定采用二氨基二甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白分析试剂盒。

2.2 定性分析

采用溶解试验、茚三酮反应和碘-碘化钾反应[21]。

2.3 贯筋藤多糖中单糖组分的气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

2.3.1 多糖的水解

称取贯筋藤多糖15 mg，加入3 mol/L 三氟乙酸10 mL，于120℃水解4 h，取出冷却后，减压蒸干，放置于干燥器中备用。

2.3.2 乙酰化衍生物的制备

取星虫多糖水解后的干燥品8 mg，加入10 mg 盐酸羟胺，0.5 mL 吡啶，于90℃油浴中反应30 min。加入0.5 mL 乙酸酐，在90℃油浴乙酰化30 min，反应产物减压蒸干。用1 mL 的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22 μm有机滤膜过滤。取上层吡啶层进行GC-MS 分析。

2.3.3 单糖对照品衍生物的制备

同2.3.2中的方法制备对照品鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖制备单糖乙酰化衍生物各1.0 mL。

2.3.4 空白溶液的制备

操作步骤同2.3.3，试管中不加多糖样品。

2.3.5 色谱条件

按照刘玉明等[22]的GC-MS 参数并做适当修正：DB-5MS UI 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气；汽化室温度250℃；程序升温，起始温度100℃，以5℃/min 升至200℃，保持1 min，再以10℃/min 升至250℃，保持5 min；载气流速1.0 mL/min，分流比20∶1，进样量1 μL；接口温度280℃；电离方式为EI；电子轰击能量70 eV；溶剂延长时间5 min；全扫描范围：50 m/z～800 m/z，选择离子扫描。根据峰面积归一化得单糖组成的相对质量分数。在上述色谱条件下，先将标准单糖衍生物混合液进样，记录色谱峰的保留时间、衍生物的峰位置，供试品溶液和空白溶液随后进样。

2.4 数据统计分析

分析结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS16.0软件对数据进行统计。

3 结果与分析

3.1 不同浸提温度下贯筋藤多糖的得率

浸提温度对贯筋藤多糖得率的影响见图1。

图1 浸提温度对贯筋藤多糖得率的影响Fig.1 Effect of temperature on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由图1可知，贯筋藤多糖最适提取温度应控制在70℃，得率为6.91%，适宜的温度有利于分子热运动，增强传质从而提高得率，温度在80℃～90℃区间得率缓慢下降，多糖可溶物在温度过高的情况下结构发生改变，导致溶解性降低。

3.2 不同浸提时间下贯筋藤多糖的得率

浸提时间对贯筋藤多糖得率的影响见图2。

图2 浸提时间对贯筋藤多糖得率的影响Fig.2 Effect of time on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由图2可知，浸提60 min 后，得率呈下降趋势，贯筋藤粗多糖在提取液中趋于饱和，体系黏度变大，因而未溶出的多糖的传质过程受到阻碍，溶出速率减慢；其次某些五碳环或六碳环因处理时间过长转变单糖、寡糖或低聚糖裂解而溶于乙醇的，在醇沉过程中有所损失，因此选择最适提取时间为60 min，多糖得率为7.00%。

3.3 不同料液比下贯筋藤多糖的得率

浸提料液比对贯筋藤多糖得率的影响见图3。

图3 料液比对粗多糖得率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由图3可知，在提取温度70℃、提取时间60 min、料液比1∶20（g/mL）时，贯筋藤多糖的含量达7.03%，虽然未经过其他辅助提取，与其他物理单次提取藤茎类植物多糖文献报道类似。原因是溶剂体积小时，多糖溶解不充分，随着提取溶剂的增加，溶剂与茎秆的接触面积增大，加快了多糖的溶出，其次多糖充分溶胀，也有利于多糖的溶出，但溶剂体积过大，使后续中的浓缩时间增加，必然使多糖在浓缩过程中有较多损失，反而使多糖得率下降。

3.4 贯筋藤茎中粗多糖提取最佳条件的确定

对提取温度、提取时间和提取次数进行L9（34）正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

由表2极差R 的大小顺序可知，影响贯筋藤粗多糖得率的各因素主次关系为：浸提温度〉料液比〉浸提时间，最佳提取工艺为A2B2C3，即浸提温度75℃，料液比1∶25（g/mL），浸提时间60 min。根据试验结果进行方差分析，进行贯筋藤茎中粗多糖的提取试验过程中，料液比、浸提温度对贯筋藤粗多糖的得率影响p 值分别为0.010 9，0.048 2，0.030 6，均达显著水平（p〈0.05），说明试验数据可信。在此优化工艺条件下，重复试验3 次，测得均总多糖的含糖量为7.04%。

3.5 贯筋藤多糖的理化性质

1）贯筋藤多糖脱色后呈灰白色粗粉状，微甜涩味，具有植物清香和焦糖味，易溶于水，不溶于无水乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。贯筋藤多糖可能含有酚型化合物而颜色较深，浓缩液经弱碱性纤维素树脂脱色由棕色变为微黄的黏稠状液体。2）碘-碘化钾反应呈阴性，茚三酮反应呈弱阳性，说明可能为非淀粉性多糖、含有少量的氨基酸、多肽或蛋白质。

3.6 贯筋藤多糖的得率、总糖含量、硫酸基含量及贯筋藤蛋白含量

经提取工艺优化的贯筋藤多糖得率为7.04%。根据标准曲线：y=8.442 3x+0.015 9（R2=0.939）计算出多糖的总糖含量为16.7%。根据标准曲线：y=4.099 1x+0.009 1（R2=0.951）计算出多糖的硫酸基含量为0.17%。硫酸多糖是多糖分子链中单糖分子的部分羟基被硫酸基取代而形成的一类多功能活性物质，研究表明，多糖的许多生物活性功能与硫酸基含量（糖基所带硫酸基的个数）有直接关系[23]。根据标准曲线和使用的样品体积计算出贯筋藤茎秆的蛋白浓度，标准曲线：y=0.652 1x+0.133 4（R2=0.995），蛋白浓度为7.243 mg/mL。

3.7 贯筋藤多糖的单糖组成

多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接在一起，具有多个极性基团，不能直接挥发的大分子物质，因此进行气相色谱分析时需将大分子多糖降解为具有易挥发，对热稳定的单糖或寡糖衍生物，本研究所采用的盐酸羟胺肟化和乙酸酐乙酰化衍生法能有效克服由于糖的异构体产生而造成的多峰现象，每种单糖都能获得单一的色谱峰，利于进行气相色谱的定性分析，贯筋藤多糖乙酰化衍生产物的GC-MS 图谱见图4。

混合标准单糖和贯筋藤多糖各峰的出峰时间、峰面积见表3。

图4 贯筋藤多糖水解物色谱图Fig.4 Chromatogram of polysaccharide hydrolysate from Dregea sinensis Hemsl.

表3 贯筋藤多糖色谱信息Table 3 The information of chromatography in polysaccharide of Dregea sinensis Hemsl.

7个单糖标准品的顺序为鼠李糖：11.339 min；岩藻糖：12.509 min；阿拉伯糖：14.569 min；木糖：15.000 min；甘露糖：15.498 min；葡萄糖：16.815 min；半乳糖：19.998 min。通过与单糖标准品保留时间和离子碎片确定贯筋藤多糖由岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，果糖未检出，其中葡萄糖和半乳糖摩尔百分含量达到90%以上，说明贯筋藤多糖主要是由葡萄糖和半乳糖组成，由表3可知，其百分含量分别为葡萄糖80.3 %、半乳糖11.7 %、甘露糖3.98 %、阿拉伯糖3.69%、岩藻糖0.349%。

4 讨论

采用水提醇沉法提取多糖存在一个缺陷，部分分子量较小的多糖会保留在上清中，而使多糖的测定结果偏低。多糖的提取方法还有酸提法、碱提法、超声辅助法、冻融辅助法等[24]，低温低压提取、增压提取及超临界流体萃取法[25]。孙晓雪等[26]对比了传统的Sevag法，三氯乙酸法和胰蛋白酶法脱蛋白对多糖损失率的影响，得出酶法的脱蛋白率最高和多糖损失率最低，在忽略成本的条件下，利于多糖后续的分离纯化，其中多糖中蛋白质的含量可采用考马斯亮蓝染色法。除单糖组成外，官能团的差异、分子量的大小均能影响多糖的生理活性，对单糖进行进一步分离纯化后研究其构效关系，可采用红外光谱，通过检测特征峰、峰宽、峰距离推测分子内和分子间的氢键、糖苷键、官能团的情况，扫描电镜、原子力显微镜等表征待测多糖结构，并结合体外体内抗氧化、降血脂、降血糖等活性[27]。董竹平等[28]认为多糖的三螺旋螺旋结构与其生理活性有关。Maeda 等[29]发现具有三螺旋结构的 β-（1，3）葡聚糖比不具有三螺旋结构的该葡聚糖具有更强的抗肿瘤和免疫调节作用。

5 结论

贯筋藤多糖脱色后呈灰白色粗粉状，微甜涩味，具有植物清香和焦糖味，属于非淀粉性多糖，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖5种单糖组成，葡萄糖和半乳糖是贯筋藤多糖的主要成分，多糖提取工艺为料液比为1∶25（g/mL），浸提温度75℃，浸提时间60 min，多糖得率7.04%，总糖含量为16.7%。研究为贯筋藤植物的开发及综合高效利用提供科学依据。