响应面优化超临界CO2萃取陈皮多甲氧基黄酮研究

吕小健，许引，董攀飞，徐兰英，李士明，龙涛，*，王运利

（1.武汉纺织大学 化学与化工学院，湖北 武汉 430200；2.黄冈师范学院 化学化工学院 催化材料制备及应用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000）

陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium），为芸香科柑桔属植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，是一种传统的药食同源的材料[1]，具有燥湿化痰、理气健脾等功效[2]。现代药理作用研究表明，陈皮中多甲氧基黄酮类成分具有抗炎[3]、抗癌[4]、抗动脉粥样硬化[5]、抗氧化[6]等生物活性。因此，陈皮近年来被广泛开发为各种功能性保健食品、食用香料添加剂等[7]。

多甲氧基黄酮（polymethoxyflavones，PMFs）是柑橘种属中所特有的黄酮类化合物[8]，在柑橘种属果皮中含量尤为丰富，其分子空间构型呈平面型，极性较小，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂[9]。陈皮中多甲氧黄酮提取的传统方法有索氏提取法[10]、有机溶剂提取法[11]、酶解提取法[12-13]、超声辅助提取法[14]、微波辅助提取法等[15]，然而这些方法存在耗时长、操作过程繁琐、收率较低、大量使用有机溶剂造成环境污染等缺点。本研究运用超临界CO2流体萃取法，其原理是用高压状态下的液态CO2进行萃取，然后减压使CO2气化，释放出萃取产物。该提取工艺不仅总黄酮得率高，而且具有后续产品分离工艺简单、无溶剂污染等优点。

川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮、橘皮素在陈皮中的含量较为丰富，是陈皮中3种主要多甲氧基黄酮，本文以这3种黄酮总量作为江西陈皮总多甲氧基黄酮含量指标，通过Box-Behnken组合试验设计、响应面法探究超临界CO2流体萃取陈皮多甲氧基黄酮最佳工艺，为陈皮的开发与综合利用提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈皮：黄州汇康药材批发市场，产地为江西。

无水乙醇、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；液态CO2（纯度99.5%）黄冈大江东有限公司；川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素标准品为催化材料制备及应用湖北省重点实验室自制（已通过核磁和质谱鉴定结构，含量采用高效液相色谱峰面积归一化法计算均不低于98%）。

1.2 仪器与设备

HA220-50-06 型超临界流体萃取装置：江苏南通华安超临界萃取有限公司；CCA-20 型低温冷却水循环泵、SHZ-DⅢ型循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DS-5510DT 型超声波清洗器：上海生析超声仪器有限公司；BSA124S 分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LC-20A 型高效液相色谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 陈皮预处理

陈皮于烘箱中60℃条件下干燥12 h，粉碎后过40 目筛，取粗颗粒进行萃取试验。

1.3.2 工艺流程

陈皮→干燥→粉碎→过筛→称重→超临界萃取→总黄酮萃取液→旋蒸干得到稠膏→HPLC 分析检测，计算川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素的总得率。

1.3.3 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）条件

GL Sciences Intersil C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～50 % 乙腈；15 min～20 min，50 %～70 % 乙腈；20 min～25 min，70%～85%乙腈；25 min～30 min，85%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：326 nm；进样量：10 μL。

1.3.4 川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素标准溶液工作曲线的绘制及其得率的计算

精密称取0.005 0 g 川陈皮素标准品，用色谱级甲醇超声波辅助溶解于10 mL 的容量瓶中，定容，配制成0.5 mg/mL 的标准物质的储备液。采用逐步稀释法得到0.5、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5 mg/mL 等一系列不同质量浓度的标准工作溶液，过0.22 μm 滤膜后进样，HPLC 检测分析。根据浓度对峰面积绘制工作曲线，得到川陈皮素标准曲线方程为Y=31.719X+89.264（R2=0.999 9），按照以上方法得3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素的标准曲线方程分别为Y=22.683X+140143（R2=0.9995）和Y=37.632X+10.145（R2=0.9999）。

将超临界萃取液旋蒸得稠膏并称重（m1），取适量稠膏（m2）超声辅助溶解于色谱甲醇，并定容到一定体积（V），HPLC 检测，将峰面积代入工作曲线方程，得川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素的浓度，再按公式（1）计算总得率：

式中：X1、X2和X3分别为稠膏中川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素的浓度，μg/mL；ω 为总黄酮得率，mg/g；V 为稠膏定容后所得体积，mL；m0为陈皮原料质量，g；m1为稠膏质量，g；m2为取出稠膏的质量，mg。

1.3.5 超临界CO2萃取的单因素试验

在超临界CO2流体萃取中，固定萃取分离罐Ⅰ、Ⅱ的温度分别为45、50℃，压力分别为6、8 MPa，在乙醇挟带剂用量为300 mL 的条件下，以萃取得到的川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黄酮和橘皮素3种黄酮总量作为总多甲氧基黄酮得率，探索萃取时间分别为30、60、90、120、150 min，萃取温度分别为35、40、45、50、55、60℃，萃取压力分别为15、20、25、30、35 MPa时对陈皮中总多甲氧基黄酮得率的影响，初步确定各单因素的影响程度和最佳萃取条件。

1.3.6 总黄酮萃取工艺的优化

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 方法，以萃取时间（A）、萃取温度（B）和萃取压力（C）3个因素为自变量，以总多甲氧基黄酮得率为响应值，进行响应面优化见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 萃取时间对总多甲氧基黄酮萃取得率的影响

在萃取釜温度为50℃，压力为20 MPa，乙醇挟带剂用量为300 mL 的条件下，萃取时间分别为30 min、60、90、120、150 min 时，分别计算总多甲氧基黄酮萃取得率，结果如图1所示。

图1 时间对总黄酮得率影响曲线图Fig.1 Effect of time on the yield of total PMFs

由图1可见，萃取时间从30 min 到90 min，总多甲氧基黄酮得率持续上升，萃取时间为90 min 时总多甲氧基黄酮得率达到最大，90 min 之后随着萃取时间延长，总多甲氧基黄酮得率不再继续增加。这是因为萃取刚开始时，由于CO2流体与陈皮粉末颗粒未达到充分接触，因而收率较低；后续随着萃取时间延长，CO2流体与陈皮颗粒混合越来越充分，传质速率提高，因而总多甲氧基黄酮得率快速增加；当总多甲氧基黄酮得率达到最大值后，由于陈皮粉末颗粒中的多甲氧基黄酮成分含量大大降低，随萃取时间延长，总多甲氧基黄酮得率并无明显增加。因此，确定最佳萃取时间为90 min。

2.2 萃取温度对总多甲氧基黄酮萃取得率的影响

在萃取釜压力为20 MPa，萃取温度分别为35、40、45、50、55、60℃，乙醇挟带剂用量300 mL 条件下萃取90 min，分别计算总多甲氧基黄酮萃取得率，结果如图2所示。

图2 温度对总黄酮得率影响曲线图Fig.2 Effect of temperature on the yield of total PMFs

由图2可见，在温度为35℃到55℃之间，随温度升高，总多甲氧基黄酮得率不断增加，55℃时得率达到最大值，之后随温度上升，总多甲氧基黄酮得率反而呈现下降趋势。温度对超临界流体溶解能力的影响较为复杂，在一定压力条件下，温度升高有利于溶质挥发和扩散，从而使萃取得率增大；另一方面，温度过高时超临界流体密度降低，多甲氧基黄酮在超临界流体中的溶解度减小，不利于萃取。综上可确定最佳萃取温度为55℃。

2.3 萃取压力对总多甲氧基黄酮萃取得率的影响

固定萃取釜温度为55℃，压力分别为10、15、20、25、30 MPa，乙醇挟带剂用量300 mL 条件下，萃取90 min，分别计算总多甲氧基黄酮的萃取得率，结果如图3所示。

图3 压力对总黄酮提取率影响曲线图Fig.3 Effect of pressure on the yield of total PMFs

由此可见，压力从10 MPa 升高到25 MPa 时，总多甲氧基黄酮得率从呈明显上升趋势，压力为25 MPa 时多甲氧基黄酮得率最高，总当压力超过25 MPa 时，总多甲氧基黄酮萃取得率基本保持不变。这是因为萃取温度一定时，随压力增加，CO2流体密度增大，溶剂的溶解能力随之增大，因而多甲氧基黄酮萃取得率增加。但当压力达到一定值后，CO2流体液态性质明显，继续增加压力，流体密度及溶解能力改变较小，因而多甲氧基黄酮萃取得率变化不大。且压力增加，操作风险增大，因此固定萃取压力为25 MPa。

2.4 响应面试验优化陈皮多甲氧基黄酮萃取工艺

以萃取时间（A）、萃取温度（B）和萃取压力（C）为考察因素，以总多甲氧基黄酮得率为响应值，进行响应面试验设计，设计结果如表2所示，方差分析见表3。

表2 萃取工艺优化响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of optimal response Surface for extraction process

表3 回归方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

续表3 回归方程方差分析Continue table 3 Regression equation analysis of variance

将试验数据利用Design Expert 软件对各因素进行多元回归拟合，得到以得率为响应值的二阶线性回归方程为：Y =1.69 +0.077A +0.16B +0.17C +0.040AB -0.037AC+0.11BC-0.21A2-0.070B2-0.23C2。

由表3可知，该回归模型的P 值〈0.000 1，说明回归模型的影响达到极显著水平；模型的失拟项P〉0.05，表明失拟项不显著。模型的总决定系数R2=0.975 3，表明该模型能解析97.53%的响应变化，说明该模型拟合良好。校正决定系数R2Adj=0.943 4，说明该模型响应值的变化有94.34%来源于所选变量。响应值Y 的变异系数CV=4.16%〈5%，说明试验的重复性良好。萃取条件的3个因素对响应值的影响大小顺序为A〈B〈C。一次项A、B、C，交互项BC，二次项A2，B2影响极显著（P〈0.01），二次项C2项影响显著（P〈0.05）；其他因素影响不显著（P〉0.05）。通过Design-Expert 软件绘制萃取时间和温度、萃取时间和压力、萃取温度和压力交互作用的响应面及等高线，结果见图4。

图4 各因素两两交互作用影响的响应面Fig.4 Response Surface of the interaction of various factors

由图4b可知，总多甲氧基黄酮得率随着萃取温度和压力的升高呈现先上升后下降的趋势，曲面较为陡峭，等高线呈现椭圆形，说明萃取温度和压力的交互作用极显著（P〈0.01）；由图4a 和4c可知，曲面较平缓，等高线呈现圆形，说明萃取时间和压力间、萃取时间和温度间的交互作用不显著（P〉0.01）。

2.5 响应面条件的确定

通过Design Expert 预测分析得到陈皮中总多甲氧基黄酮的最佳萃取工艺条件为萃取时间66.9 min，温度55℃，压力28 MPa，得率达到1.879 mg/g。考虑到实际操作的可行性，萃取工艺参数调整为萃取时间67 min，温度55℃，压力28 MPa，在此条件下，做3 次平行试验，总多甲氧基黄酮得率为1.89 mg/g，与预测值相对偏差为0.59%，表明响应面法优化得到的陈皮中总多甲氧基黄酮的萃取工艺条件是可靠的。

3 结论

本研究运用超临界CO2流体萃取技术，对陈皮中的多甲氧基黄酮进行萃取。试验以总多甲氧基黄酮得率为指标，探讨了时间、温度、压力3个条件对超临界CO2流体对陈皮中多甲氧基黄酮萃取的影响，萃取条件对总多甲氧基黄酮得率影响大小依次为压力、温度和时间，根据单因素试验确定最佳萃取条件为压力25 MPa、温度55℃、萃取时间为90 min。在此基础上进行响应面法优化并结合操作可行性，得到最佳萃取工艺条件为萃取时间67 min，温度55℃，压力28 MPa，总黄酮得率达到1.89 mg/g。