田鼠巴贝斯虫棒状体蛋白相关因子1基因的原核表达及其特性研究

蒋艺佳，肖雯雯，聂 政，敖阳思琦，李慕晓，何 沛，周金林，赵俊龙，贺 兰

（1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

巴贝斯虫病是由巴贝斯属的多种巴贝斯虫寄生于动物红细胞内引起的一种血液原虫病，为人畜共患病[1]。该病主要通过硬蜱传播，也可通过输血传播和胎盘传播，其发生与流行具有明显的季节性和地区性。发病的典型症状为高热、溶血性贫血、黄疸、血红蛋白尿等，严重可导致死亡。一般免疫正常的人感染巴贝斯虫后无明显临床症状，但当其免疫力下降时，症状表现明显，危害极大。

据文献[2]报道，多种巴贝斯虫具有人畜共患的能力，其中一种即为田鼠巴贝斯虫（Babesia microti，B. microti）。1969年，美国东海岸报道了一例人的巴贝斯虫病，其病原为田鼠巴贝斯虫。此后相似病例相继发生，在当地引起极大轰动，随后美国建立了专门研究田鼠巴贝斯虫的实验室；1977年，台湾报道了啮齿类巴贝斯虫感染病例。同年，研究人员在几位居民血清中检验出田鼠巴贝斯虫抗体。近年来，田鼠巴贝斯感染人的相关病例逐渐增多[3]，引起人们的重视。

巴贝斯虫的分子生物学研究表明，多种蛋白在虫体感染机体的过程中发挥了重要的作用。GPI锚定裂殖子表面抗原（merozoite surface antigen，MSA）包裹在虫体表面，从而有效地与靶细胞黏附，且编码该抗原的表位基因片段存在大量多态性，可能与牛巴贝斯虫的免疫逃避机制有关[4-6]；顶膜抗原1（apical membrane antigen-1，AMA1）是一种分泌到虫体表面的蛋白，其中分歧巴贝斯虫天然AMA1的蛋白水解产物可与红细胞表面的相关受体结合，在虫体入侵红细胞的过程中发挥了重要的作用[7-8]；棒状体相关蛋白1（rhoptry-associated protein1，RAP1）存在于所有的巴贝斯虫种类中，且针对该蛋白的一些抗体可阻断裂殖子的入侵，预示该蛋白可作为巴贝斯虫免疫性保护的重要靶标[9-10]。

然而，目前对田鼠巴贝斯虫的研究相对较少，对该病的诊断主要依赖于红细胞染色镜检，存在染虫率低及非急性感染诊断困难的问题。因此，建立检测田鼠巴贝斯虫血清学检测方法极为重要。有研究表明，一种新型的田鼠巴贝斯虫分泌蛋白（BmSA1）具有良好的诊断潜力[11]，但全长蛋白的表达量少，也不宜纯化。因此，探索是否存在其他可作为田鼠巴贝斯虫血清学检测的候选分子极其有意义。

本实验以田鼠巴贝斯虫RAPIF1基因为研究对象，利用生物信息学分析软件对其进行序列分析[12-13]，预测其亲水性/疏水性、跨膜区、信号肽、翻译后修饰位点、B淋巴细胞抗原表位等特性；并通过克隆载体与表达载体的构建[14-15]，对其进行基因克隆与原核表达；运用SDS-PAGE、Western blot等方法检测其免疫反应原性，评价RAPIF1是否具有成为田鼠巴贝斯虫诊断和疫苗制备候选分子的可能。

1 材料与方法

1.1 虫株、菌株、载体、实验动物、主要试剂 田鼠巴贝斯虫（Babesia microti，B. microti）PRA-99株由本实验室提供，液氮保存；田鼠巴贝斯虫阳性血清由人工感染实验制备，保存于-20℃；Balb/c小鼠、昆明鼠购于华中农业大学实验动物中心；大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21由本实验室制备，-80℃保存；克隆载体pEASY-Blunt、表达载体pET-28a(+)购于北京氏金生物技术有限公司，-20℃保存；限制性内切酶BamH 1、Xho1、TaqDNA聚合酶、dNTPs购自宝生生物工程（大连）有限公司，-20℃保存。氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、二硫苏糖醇（DTT）、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）购自Amresco公司；牛血清白蛋白（BSA）、咪唑、考马斯亮蓝R250购自Biosharp公司；弗氏完全与不完全佐剂购自Sigma公司；预染与非预染蛋白Marker购自Thermo公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA胶回收试剂盒、DNA分子量标准、His-tag镍亲和层析介质（ProteinPure Ni-NTA Resin）购自北京全氏金生物技术有限公司；蛋白浓度测定试剂盒、HRP标记羊抗鼠IgG购自江苏南通碧云天生物科技研究所；LB液体培养基由本实验室制备，高压蒸汽灭菌后备用；其他各类试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 DNA模板的提取与DNA回收 根据田鼠巴贝斯虫RAPIF1基因的核苷酸序列（GenBank登录号：XP_012647190.1），利用Clone Manager 8软件设计1对特异性引物，上游引物：5'-ATGGGCCTTTCTGATAATCTG- 3'，下游引物：5'-TTAACAGCCAATGCAACCAG- 3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取田鼠巴贝斯虫gDNA，扩增其开放阅读框。用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 RAPIF1基因的原核表达 根据同源重组原理，利用Clone Manager 8软件设计RAPIF1的特异性引物，上游引物：5'-GCAAATGGGTCGCGGATCCA TGGGCCTTTCTGATAATCTGTGC-3'，下游引物：5'-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTAACAGCCA ATGCAACCAGC-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用特异性引物和KD酶扩增RAPIF1，胶回收扩增产物。将回收产物与表达载体pET-28α相连接后。转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃振荡培养1 h，涂布在含有卡那霉素平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的单菌落，PCR鉴定，筛选阳性克隆。转化大肠杆菌感受态细胞BL21，同样筛选阳性克隆。将阳性克隆菌振荡培养3 h，使菌处于对数生长期，加入诱导剂IPTG 0.8 mmol/L，28℃振荡培养12 h，诱导其表达重组蛋白。同时设置阴性对照。取1.5 mL菌液，8000 ×g离心3 min，去上清；用40 μL ddH2O重悬沉淀；加50 μL 2% SDS上样缓冲液，加10 μL DTT（二硫苏糖醇）；沸水浴10 min，冰浴5 min。每孔上样10 μL，跑胶；考马斯亮蓝染色液染色2 h，脱色液脱色至条带清晰可见。

1.4 重组蛋白的纯化 将诱导表达的菌液，在4℃的条件下，集菌，用压力破碎仪破碎3次，12 000×g离心10 min，分离上清与包涵体，将上清经过滤器过滤后与镍柱结合2 h，然后分别用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%咪唑洗脱。处理不同浓度咪唑的洗脱物，SDSPAGE电泳，收集洗脱蛋白，于PBS溶液中透析48 h，用蔗糖浓缩。

1.5 多克隆抗体的制备 在免疫昆明鼠前，采血获阴性血清。将浓度为0.5 mg/mL的rRAPIF1与佐剂1∶1混合乳化，皮下注射免疫昆明鼠，每次免疫的rRAPIF1量为50 μg。分别于免疫后的0、14、28 d进行一免、二免和三免，三免后间隔10 d加强免疫一次，加强免疫后7 d收集鼠血清，经纯化获得多克隆抗体。

1.6 Western blot 处理纯化的重组蛋白与全虫抗原样品，SDS-PAGE电泳，将3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸按顺序叠放在电转仪阴极石墨板中央，电压最大值，电流1.0 mA/cm2大小 ，稳流电转2 h。电转结束后，用5%脱脂奶4℃封闭过夜，TBST洗膜，3 min洗3次，5 min洗5次。加入用TBST 1∶400稀释的血清，室温孵育2 h，洗膜。加入用TBST 1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温避光孵育1 h，同上洗膜。用Odyssey CLx（红外激光成像仪）照胶。

2 结果

2.1 基因克隆与鉴定 利用设计的特异性引物从田鼠巴贝斯虫基因组中扩增出771 bp的目的片段（图1）。将该片段与克隆载体pEASY-Blunt连接，转化克隆后，挑取阳性克隆用BamH1/Xho1双酶切鉴定：两个片段大小分别为852、3848 bp（图1）。目的片段的序列与田鼠巴贝斯虫基因组数据库的RAPIF1基因序列比对结果显示，序列一致性为100%。

2.2 序列分析

2.2.1 基本理化性质 利用ExPASy-ProtParam工具分析可知，RAPIF1基因编码256个aa（图2），分子质量为29 kDa，等电点为5.09，在水中280 nm处的摩尔消光系数为27 305 mol/cm。该蛋白分子式是C1289H2068N340O403S11，富含缬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等，其中缬氨酸占比13.7%。在体外哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h，体外酵母菌内的半衰期＞20 h，体外大肠杆菌内的半衰期＞10 h，不稳定系数为39.25，可认为其属于稳定蛋白。脂肪指数为89.26，亲水性平均系数为-0.409，为亲水性蛋白。

2.2.2 亲水性/疏水性 利用ExPASy-ProtScale、Kyte&Doolittle分析可知，该蛋白含有多个亲水区，分别位于氨基酸序列位点8～54、82～89、124～132、146～207、240～250（图3A），结合其亲水性平均系数为-0.409，可进一步证明其为亲水性蛋白。

2.2.3 跨膜区 跨膜区的主要作用是把膜蛋白固定在细胞膜上，因此分析蛋白质是否含有跨膜区，对其定位与定性具有指示意义。利用TMHMM隐马尔科夫模型分析显示，该蛋白无跨膜区，预测其不是跨膜蛋白（图3B）。

图1 RAPIF1基因的PCR扩增与pEASY-Blunt- RAPIF1重组质粒的双酶切鉴定Fig.1 PCR amplification results of RAPIF1 gene and identification of pEASY-Blunt-RAPIF1 recombinant plasmid with restrictive enzyme digestion

2.2.4 信号肽 利用SignalP 4.1 server对蛋白的信号肽进行预测，C-score为信号肽剪切位点分值，S-score为信号肽位点分值，Y-score为综合位点剪切分值。结果显示，C-score、S-score、Y-score三值波动幅度较小，且无突出Y-score的最大值，判断该蛋白无信号肽（图3C）。

2.2.5 翻译后修饰位点预测 利用Motif scan对该蛋白的修饰性位点进行预测，结果显示，序列中存在酪蛋白激酶2磷酸化位点3个，N-酰化位点1个，蛋白激酶c磷酸化位点4个，N-糖基化位点1个（表1）。

2.2.6 B淋巴细胞抗原表位分析 B细胞表位通常能被宿主免疫系统识别，刺激机体产生特异性免疫。为进步探究其作为疫苗或者诊断分子的可能性，利用DNASTAR对RAPIF1潜在B细胞的表位进行预测。结果显示，RAPIF1存在7个主要的B淋巴细胞抗原表位，其氨基酸序列位点分别为23～26、39～46、127～131、152～155、168～174、203～207和245～249（表2、图4）。

2.3 原核表达与纯化 将重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，对挑取的单菌落进行菌液PCR鉴定。将鉴定验证为阳性的重组质粒pET-28a-RAPIF1转入E.coliBL21中诱导表达，表达产物命名为rRAPIF1。SDS-PAGE鉴定结果显示，诱导样品在37 kDa处条带明显增粗（图5）。根据RAPIF1大小为29 kDa，pET-28a重组载体表达的His标签大小为8 kDa可知，rRAPIF1大小与理论预测值相符。纯化rRAPIF1蛋白电泳结果显示清晰的单一条带，大小为37 kDa，见图5。

图2 RAPIF1的开放阅读框核苷酸与氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of RAPIF1 ORF

2.4 反应原性鉴定 rRAPIF1分别与田鼠巴贝斯虫阳性血清和阴性血清与之反应，结果显示阳性血清与重组蛋白在37 kDa处有单一的反应条带，而阴性血清无任何条带（图6），表明该重组抗原可有效区分田鼠巴贝斯虫阴性阳性血清，具有良好的反应原性。用田鼠巴贝斯虫全虫抗原，分别与RAPIF1的多克隆抗体和鼠阴性血清反应，结果显示仅多克隆抗体与全虫抗原29 kDa处显示单一的条带（图6），表明RAPIF1存在于虫体中。

图3 RAPIF1的特性分析Fig.3 Analysis of RAPIF1

表1 RAPIF1的功能性位点预测Table 1 Post-translational modification(PTM)sites of the putative RAPIF1

表2 RAPIF1的B淋巴细胞抗原表位氨基酸序列Table 2 Potential B cell antigen epitopes position and sequences

图4 RAPIF1的B淋巴细胞抗原表位分析Fig.4 Potential B cell antigen epitopes prediction of RAPIF1

图5 rRAPIF1的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of rRAPIF1

图6 rRAPIF1的Western blot 分析Fig.6 Western blot analysis of rRAPIF1

3 讨论

棒状体相关蛋白1（RAP1）存在于所有巴贝斯虫中，在虫体入侵过程中起到重要作用，且针对该蛋白的一些抗体可阻断或抑制虫体入侵[16]。因此，RAP1的功能研究、特异性疫苗制备与靶向药物筛选是预防与治疗巴贝斯虫病的一个重要方向。根据其他一些巴贝斯虫入侵相关因子[17-18]，如GPI锚定裂殖子表面抗原（MSA）、顶膜抗原1（AMA1）、凝血酶敏感素相关无名蛋白（TRAP）[19]、硫氧还蛋白（Trx）与硫氧还蛋白还原酶（Trx R）[20]等在虫体入侵过程中发挥的重要作用，这些分子极有可能成为巴贝斯虫免疫性保护的重要靶标。

然而，目前田鼠巴贝斯虫病的相关研究及成果仍相对较少，主要集中在虫体侵袭过程中一些较为明确的重要抗原上，对其他一些未知因子的研究尚不清楚或深入。因此，在本研究中，我们将目光投向田鼠巴贝斯虫棒状体蛋白相关因子1（RAPIF1），探索RAPIF1是否具有类似于RAP1的免疫特性，在虫体感染过程中发挥重要的作用。

本研究根据已报道的田鼠巴贝斯虫基因组数据库，设计特异性引物，成功扩增到RAPIF1基因，其全长771 bp，编码256 aa。利用多种生物信息学分析软件对RAPIF1的基本理化性质、亲水性/疏水性、跨膜区、信号肽、翻译后修饰位点及B淋巴细胞抗原表位等进行预测[21]，该蛋白为亲水性蛋白，无跨膜区与信号肽，有较丰富的修饰性位点与B淋巴细胞抗原表位。

本实验在获得田鼠巴贝斯RAPIF1的cDNA（全长771 bp）的基础上，将RAPIF1插入表达载体pET-28a中，并在大肠杆菌BL21中成功地表达了重组蛋白rRAPIF1。rRAPIF1在上清和包涵体中均有表达，且以上清表达形式为主。本研究利用His镍柱纯化重组蛋白，获得了纯度较高的蛋白。免疫印迹分析表明，rRAPIF1与田鼠巴贝斯虫阳性血清反应，说明该蛋白具有良好的反应原性，免疫后的多克隆抗体可与全虫抗原反应，说明RAPIF1存在于虫体中，RAPIF1预期可作为田鼠巴贝斯虫疫苗制备的候选抗原。