不同激活状态的巨噬细胞对流行性乙型脑炎病毒感染的影响

徐晓伟，魏建超，刘 珂，邵东华，李蓓蓓，曹瑞兵，陈溥言，马志永，胡敬东, 邱亚峰

（1. 山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；3.南京农业大学动物医学院，南京 210095）

流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种神经嗜性的黄病毒[1]。该病毒通过蚊子传播，可感染水鸟、猪、犬等多种宿主，表现为病毒性脑炎，又称日本乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）。人和马是JEV的终末宿主。JE的分布具有一定的区域性，主要分布在南亚和东南亚地区。根据世界卫生组织的统计数据，JEV感染每年可导致10 000～15 000人死亡[2-3]。JEV感染具有重要的公共卫生意义，但是，目前对JE的免疫致病机制的理解还不十分清楚。

巨噬细胞是机体的主要免疫细胞，在宿主的先天性免疫和获得性免疫反应中都起着重要的作用。在蚊子叮咬过程中，巨噬细胞如朗汉斯细胞是最先识别JEV感染的免疫细胞。研究显示，相对于非免疫细胞如Vero细胞[4]、MEF细胞等[5]，巨噬细胞具有明显的抑制JEV感染作用，这与巨噬细胞诱导快速及高水平的I型干扰素相关。另外，激活的巨噬细胞如IFN-γ诱导的巨噬细胞，可通过促进NO的产生抑制JEV的复制[6]。因此，巨噬细胞的激活状态影响JEV的感染。

根据激活状态，巨噬细胞主要分为M1型巨噬细胞（主要由Th1细胞因子如IFN-γ等诱导产生）、M2型巨噬细胞（主要由Th2细胞因子如IL-4等诱导产生）[7-8]。虽然已有的研究显示M1型巨噬细胞可通过促进NO的产生抑制JEV的复制，但是，目前对M2型巨噬细胞是影响JEV感染的具体机制还不清楚。

为了解析不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响，本研究利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为模型，分别通过IFN-γ和IL-4将巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，分析JEV强毒株NJ2008[9]在巨噬细胞中的感染情况。

1 材料和方法

1.1 细胞和病毒 C6/36细胞由本实验室保存，培养于含有10%胎牛血清的SF9培养基中，置于28℃的细胞培养箱中培养。BHK-21细胞和RAW264.7细胞购置于中科院细胞库，于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。上述培养基、胎牛血清购自Thermo Fisher公司。利用C6/36细胞对JEV强毒株NJ2008进行增殖，随后对增殖好的病毒利用BHK-21细胞进行病毒滴度测定。

1.2 试剂与抗体 小鼠重组细胞因子IFN-γ和IL-4购自R&D公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR Green qPCR Mix购自TaKaRa公司；抗JEV NS3多克隆抗体[10]由本实验室保存；荧光标记的二抗购自Invitrogen公司 。

1.3 M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的制备及病毒感染 将RAW264.7细胞传至24孔培养板，等长到70%满时，加入细胞因子IFN-γ（终浓度100 ng/mL）或IL-4（终浓度200 ng/mL），同时设有PBS对照组。加入IFN-γ或IL-4后24 h，细胞接种10 MOI JEV毒株NJ2008，孵育2 h后，PBS洗2次，换为含有5%胎牛血清的培养基培养至特定感染时间时，进行样品的制备。

1.4 间接免疫荧光分析 首先，将灭菌玻片放入24孔板中，按照上述的方法分别制备不同激活状态的巨噬细胞并接种10 MOI JEV毒株NJ2008。接毒后24 h，用4%的多聚甲醛进行固定，进行免疫荧光分析。利用1% NP-40打孔后，加入封闭液，室温孵育30 min；加入一抗，室温孵育30 min，洗涤3次；加入已稀释好的二抗，继续孵育30 min后，洗涤3次；加入DAPI进行细胞核染色，最后洗涤3次后，进行封片；利用荧光显微镜进行分析和拍照记录。

1.5 实时荧光定量PCR 病毒感染24 h后，利用TRIzol试剂裂解不同激活状态的巨噬细胞，根据说明书进行总RNA的提取，然后利用反转录试剂盒制备cDNA。用于实时荧光定量PCR的引物由Invitrogen公司合成。扩增Arg1、iNOS及GAPDH引物序列见文献[11]；扩增JEV E 基因的引物序列分别为JEV E-forward：5'-CCTCCGTCACCA TGCCAGTCTTAG-3'，JEV E-reverse：5'-TTCGCC ATGGTCTTTTTCCTCTC-3'。然后，根据SYBR Green qPCR Mix的说明书，进行PCR反应试剂的配置，具体的反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃退火30 s, 40个循环。通过与内标GAPDH进行比对获得相对表达量。

2 结果

2.1 JEV强毒株NJ2008在巨噬细胞及非巨噬细胞上的生长特性分析 研究表明，相对于非免疫细胞，巨噬细胞显示出明显的抗JEV的作用。JEV毒株NJ2008在巨噬细胞上的感染特性，还不清楚。因此，我们对毒株NJ2008在BHK-21细胞和RAW264.7细胞生长特性进行了分析。根据前期结果，在病毒感染前12 h，毒株NJ2008感染维持一个较低的病毒滴度（结果未显示）。为此，本研究在病毒感染后12、24、48 h取细胞上清，通过TCID50的测定比较JEV毒株NJ2008在BHK-21细胞和RAW264.7细胞上的感染情况。结果显示，尽管毒株NJ2008可以在巨噬细胞和非巨噬细胞上造成持续感染，但是，相对于在BHK-21细胞上感染增殖情况，毒株NJ2008在巨噬细胞上的复制明显受到了抑制，具体结果见图1。

图1 JEV毒株NJ2008在BHK-21细胞和RAW264.7细胞上的生长特性分析（＊ P＜0.05）Fig.1 Growth characteristics analysis of JEV strain NJ2008 on BHK-21 cells and RAW264.7 cells(＊ P＜0.05)

2.2 不同激活状态的巨噬细胞对JEV强毒株NJ2008感染的影响 已有的研究显示M1型巨噬细胞即IFN-γ诱导的巨噬细胞对JEV具有明显的抑制作用，而M2型巨噬细胞对JEV感染影响还不清楚。本研究比较了毒株NJ2008在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况。鉴于在JEV感染后24 h，病毒滴度已达到高峰，本研究选择病毒感染后24 h进行样品的制备。结果显示，相对于PBS组，M1型巨噬细胞显著地抑制JEV的复制，培养上清中检测不到病毒；相对于PBS组，JEV对M2型巨噬细胞的感染没有发生显著的变化，结果详见图2。

利用间接免疫荧光方法检测不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响。在感染JEV毒株NJ2008后24 h，IFN-γ处理组未发现阳性感染细胞，但是，PBS处理组和IL-4处理组发现了很多感染细胞，结果见图3。

图2 感染JEV毒株NJ2008的不同激活状态巨噬细胞上清中病毒滴度分析Fig.2 Virus titer analysis in supernatants of different activated macrophages infected with JEV strain NJ2008

2.3 不同激活状态的巨噬细胞影响JEV感染的可能机制 巨噬细胞抑制JEV感染的机制可能有多种，有研究显示M1型巨噬细胞即IFN-γ处理的巨噬细胞主要通过诱导NO的产生介导抗JEV的作用。进一步，在巨噬细胞中，NO产生取决于诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）的表达情况，同时，iNOS和Arg1分别为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的指示标志。最后，我们利用相对定量PCR对调控NO产生的iNOS和Arg1的表达情况以及JEV的感染情况进行了检测。结果显示，相对于PBS处理组，IL-4处理组显著地上调Arg1的表达并抑制iNOS的表达（图4），从而降低iNOS/Arg1的比值（ratio=0.0005）；而IFN-γ处理组也可上调Arg1的表达，但更显著上调iNOS的表达（图4），从而显著上调iNOS/Arg1的比值（ratio=13.266）。此外，荧光定量PCR结果显示，相对于PBS组，IFN-γ处理组中的E基因的水平显著降低，而IL-4处理组中E基因的水平没有差异（图5），与上述TICD50和间接免疫荧光的结果相符。

图3 间接免疫荧光法分析NJ2008在不同激活状态的巨噬细胞上的感染情况Fig.3 Analysis of JEV strain NJ2008 infection in differential activation of macrophages by IFA

3 讨论

巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，在宿主免疫防御中起着重要的作用。本研究结果表明，相对于非免疫细胞，巨噬细胞显示出较强的抑制JEV感染的作用。进一步的研究表明，不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的作用不同：相对于非激活状态的巨噬细胞（PBS处理组）或M2型巨噬细胞，Ⅰ型巨噬细胞显示出明显的抑制JEV感染的作用；而M2型巨噬细胞，相对于PBS组并没有显示出明显的抑制或促进JEV感染的作用。本研究较系统地比较了不同激活状态的巨噬细胞对JEV感染的影响，为将来揭示巨噬细胞在JEV感染中作用提供参考和依据。

图4 荧光定量PCR分析iNOS(A)和Arg1(B)在不同激活状态的巨噬细胞上的表达情况（＊P＜0.05）Fig.4 Expression analysis of iNOS(A) and Arg1(B)in different infected macrophages by real-time qPCR(＊P＜0.05)

图5 实时荧光定量PCR分析JEV E基因在不同激活状态的巨噬细胞上的表达水平（＊P＜0.05）Fig.5 Quantitative analysis of JEV E gene in different infected macrophages by real-time qPCR(＊P＜0.05)

JEV感染巨噬细胞维持一个相对较低的病毒滴度。首先，这与JEV感染巨噬细胞诱导I型干扰素的产生相关。他人研究显示JEV感染巨噬细胞RAW264.7后12 h已激活I型干扰素的产生，从而限制病毒的扩散，抑制已感染细胞中病毒的复制[4]。相对于I型干扰素，IFN-γ主要通过诱导NO的产生抑制JEV的复制[6]。在巨噬细胞中，Th1型细胞因子IFN-γ显著上调iNOS的表达，继而上调表达的iNOS可利用精氨酸促进NO的产生；相对而言，Th2型细胞因子IL-4显著上调Arg1的表达，然而Arg1仅消耗精氨酸不产生NO。为此，在巨噬细胞中iNOS/Arg1的比值对巨噬细胞的激活状态以及NO的产生具有指导作用。本研究显示IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞表达较高水平的iNOS，并且明显地抑制JEV的感染，这一结果与上述结果相符。因此，这些结果显示巨噬细胞具有较强的抗JEV感染的作用，不仅可通过快速产生I型干扰素抑制病毒的感染，而且可通过诱导NO的产生进一步发挥抗JEV感染的作用。

Th2免疫反应促进M2型巨噬细胞的产生。有研究显示，Th2免疫反应对JEV感染具有保护作用，这主要是与Th2免疫反应抑制促炎性因子的表达，同时，也与增加JEV特异的抗体滴度相关[12]。然而，对Th2免疫反应诱导的M2型巨噬细胞在JEV感染中的作用还不清楚。我们研究结果显示，尽管Th2细胞因子抑制促炎性因子的产生（结果未显示），促进Arg1的产生，但有意思的是，与PBS组相比，M2型巨噬细胞并未抑制JEV的复制。这一结果进一步说明了Th2免疫反应介导的抗JEV作用，主要与抑制促炎性因子的产生及增加病毒特异的体液免疫反应相关。

总之，本研究通过体外试验明确了M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞对JEV感染的影响，不仅丰富JEV与巨噬细胞相互作用的知识，而且为将来进一步揭示巨噬细胞作为一种抗原提呈细胞在JEV感染中的作用奠定基础。