不同缺血时间窗对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的影响

再灌注疗法是治疗急性心肌梗死的有效手段，但冠状动脉再通后会出现心肌缺血再灌注(MI/R)损伤，即心肌细胞因缺血发生损伤, 在血流恢复后，损伤没有减轻反而加重并诱发细胞死亡或功能障碍。本研究通过阻断大鼠冠状动脉左前降支(LAD)建立MI/R模型,并在预定时间内恢复血流，探讨不同缺血时间窗对大鼠在体MI/R损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

7～8周龄SPF级成年健康Wistar大鼠48只，雌雄比为1∶1，体质量220～250 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心[许可证号SCXK(甘)2015-0002],饲养于甘肃中医药大学实验动物中心屏障环境中[许可证号SYXK(甘)2015-0002]。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号IACUC2016-039)。将大鼠随机分为假手术组、缺血7.5min组、缺血15min组、缺血30min组，每组12只。

1.2 MI/R模型的建立方法

根据参考文献[1]的方法进行改进，大鼠术前禁食、不禁水12 h，称重标记。10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体质量) 腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈部、胸前手术野备皮，碘伏消毒，铺无菌孔巾。连接Powerlab数据采集分析系统，记录标准Ⅱ导联心电图，有异常者剔除。切开颈部气管接人工呼吸机进行辅助呼吸(潮气量5 mL/100 g体质量,频率60～80次/min，呼吸比为2∶1，予呼气末持续正压呼吸)。胸骨左侧0.5 cm处以第3、4肋骨作为上下边界纵行剪开皮肤约3 cm，钝性分离皮下组织、胸大肌直至肋间肌，用弯止血钳将皮肤和肌肉夹起固定于两侧，于心肌搏动明显处纵行剪开3、4肋骨，用撑开器撑开胸腔，用眼科镊夹破心包膜，暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间找到左冠状静脉主干，LAD与之伴行，挤出心脏，用眼科缝合线在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约2 mm处进针，进针宽度及深度均在2 mm左右，穿线后于左冠状静脉主干上置一自制小塑料管结扎。结扎成功后肉眼见左心室前壁变青紫，搏动减弱，以心电图ST段抬高(≥0.25 mV)为心肌缺血标志。分别于结扎7.5 min、15 min、30 min后用剪刀将塑料管和缝线一起剪断，形成再灌注，心电图显示ST段逐渐下降50%左右。造模结束后，依次缝合胸腔、肌肉、皮肤，再次碘伏消毒，术后腹腔注射青霉素预防感染。

1.3 心功能测定

大鼠麻醉后，取平卧位，选用9 MHz高频矩阵探头，分别检测大鼠射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)，每项指标均测量3个心动周期，取平均值。

1.4 心肌酶水平测定

术后3 d右房取血4 mL，离心，取血清，以全自动生化分析仪检测大鼠天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的水平。

1.5 心梗面积测定

右房取血完毕后取出大鼠心脏，去除非心脏组织，用生理盐水洗净残血，用滤纸吸去水分后置于-20 ℃冷冻25 min。沿垂直于心脏长轴方向将心脏切成2.0 mm厚的薄片，于37 ℃的1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)中染色15 min，肉眼可见梗死区心肌为苍白色，非缺血区为红色。通过计算机图像分析软件计算梗死区面积(IA)占左心室面积(LV)的百分比，取平均值。

1.6 心肌病理组织学检查

取结扎线以下大鼠心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。

1.7 统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。成组资料比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法(方差齐者)或Tamhane法(方差不齐者)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制备情况

假手术组、缺血7.5 min组、缺血15 min组、缺血30 min组建模成功数分别为12只、12只、12只、11只。各组间大鼠建模成功率的差异无统计学意义(P<0.05)。

2.2 大鼠心电图的表现

结扎LAD后各组ST段显著抬高，伴或不伴T波低平或倒置，再灌注后ST段逐渐回落50%左右，伴T波高耸，提示建模成功，见图1。

注：A为正常心电图；B为LAD结扎后心电图；C为再灌注后心电图

2.3 术后各组大鼠心功能检测结果

应用心脏超声诊断仪，可见除假手术组外，其余各组大鼠心室壁均出现不同程度收缩幅度减弱。与假手术组相比，缺血7.5min组EF和FS无明显变化，缺血15min组、缺血30min组EF和FS均明显下降(P均<0.05)，见表1。

2.4 各组大鼠心肌酶水平变化

与假手术组相比，缺血7.5 min、15 min、30 min组CK-MB均明显升高(P均<0.05)，见表2。

表1 各组大鼠射血分数与短轴缩短率比较

注：与假手术组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01

表2 各组大鼠心肌酶水平比较

注：与假手术组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01

2.5 各组大鼠心肌梗死面积变化

TTC染色后，假手术组左室心肌呈红色，说明组织内脱氢酶活性正常，未出现心肌缺血，而其余各组左室部分心肌呈苍白色，说明组织内脱氢酶活性下降，左室部分心肌有缺血坏死现象，其中以缺血15 min组及缺血30 min组明显。见图2。

用IA/LV的百分比评价心肌梗死面积：缺血7.5 min组为(3.2±0.9)%；缺血15 min组为(14.2±7.9)%；缺血30 min组为(19.3±12.9)%。与假手术组比较，缺血7.5 min组心肌梗死面积无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，缺血15 min、30 min组心肌梗死面积明显增大(P均<0.01)。

3.6 各组大鼠心肌病理组织学检查

HE染色后可见，假手术组心肌细胞排列整齐，结构完整；缺血7.5 min组有少量炎性细胞浸润，部分心肌细胞溶解；缺血15 min组心肌细胞排列紊乱且局部溶解或断裂，炎性细胞浸润；缺血30 min组心肌纤维断裂、挛缩、心外膜下见带状梗死灶。见图3。

图2 各组大鼠心肌TTC染色结果

注：A为假手术组；B为缺血7.5min组；C为缺血15min组；D为缺血30min组

图3 各组大鼠心肌病理组织学结果(HE染色，×200)

4 讨论

在急性心肌梗死时，及时恢复心肌的血供，对于减轻心肌细胞损伤，保护心脏功能具有特殊意义。目前通过溶栓、介入治疗虽然能够实现血管再通，但恢复血供后常发生再灌注损伤，病死率依然居高不下。目前国内外基础研究中模拟人类MI/R模型应用最广泛的方法是结扎大鼠LAD使其供应区血流阻断，造成心肌缺血，但由于不同研究者采用了不同的MI/R时间，因而得出的结论也有所不同。本研究在呼吸支持下开胸结扎大鼠LAD，在缺血7.5 min、15 min、30 min后恢复血液供应，观察大鼠心肌酶、心肌梗死面积、心肌病理组织学及心功能变化，为建立优化的动物模型提供了实验依据。

心肌损伤可导致细胞膜通透性增加，使一些可溶性心肌酶透过胞质释放到冠状动脉中，会使冠状动脉血液中的心肌酶水平显著升高，故常通过检测冠状动脉流出液中CK、LDH的活性来判断心肌受损情况[2]。有研究显示缺血30 min再灌注120 min会造成MI/R损伤，而缺血15min再灌注120min不会造成MI/R损伤[3]，但本研究发现缺血15 min、30 min再灌注均会加重细胞损伤，其中以CK-MB最具特异性，这与Storrow等[4]认为CK-MB是诊断心肌梗死的“金标准”之一的观点一致。

实验动物心肌梗死面积最常见的检测方法是TTC染色[5]，本研究用TTC染色显示各组梗死面积变化，发现缺血15 min、30 min组梗死面积明显大于假手术组，说明血流再通后心肌细胞的坏死明显加重，而与缺血7.5 min组梗死面积比较无统计学差异，可能是缺血7.5 min后血流及时恢复，心肌结构恢复了正常，没有造成严重损伤。从对心肌病理形态学的研究中发现，缺血7.5 min组与假手术组的心肌细胞结构大致相同，无明显差异，而缺血15 min、30 min组心肌纤维破坏明显，细胞损伤较重，提示短时间内出现心肌缺血，心肌结构改变为可逆性，血流及时再通后心肌结构尚能恢复,不会形成再灌注损伤，而缺血时间一旦超过心肌耐受能力，心肌细胞则产生不可逆性损伤，导致可恢复功能的细胞数目明显减少，再灌注后损伤进一步加重。在本研究中，超声心动图显示，与假手术组相比，缺血7.5 min组心功能基本正常，缺血15 min、30 min组心功能明显降低。

由此可见，不同缺血再灌注时间对大鼠在体心肌损伤的影响不同，这对大鼠MI/R模型的建立具有一定参考意义。