广东石豆兰多糖的提取工艺及其抗氧化活性

苗永美，孙佳琦，徐荣华，汪 雁

安徽科技学院生命与健康科学学院，凤阳 233100

石豆兰属(Bublophyllum)为兰科最大的属，该属植物全世界约有1 000种，主要分布于亚洲、非洲和美洲热带地区。我国有一百多种，主要产于长江流域及其以南各省区，尤以云南南部为多[1]，也有新种逐渐被发现的报道[2,3]。石豆兰属植物中有些种类是中草药，常作民间药用的有15种，包括广东石豆兰、麦斛等[1]。石豆兰以全草或假鳞茎或鲜草入药，具有清热、滋阴、消肿、抗癌、抗焦虑等功效[4]。

植物多糖因有增强和调节机体免疫功能，抗衰老，抗肿瘤，抗辐射等作用而受到广泛的重视[5]。兰科植物中石斛、天麻、白芨、芋兰、杜鹃兰、石豆兰等都是重要中药材，多糖是其主要药用成分之一。关于兰科植物多糖的研究，不同植物开展的广度和深度不同，石斛[6]、白芨[7]、金线莲[8]、石仙桃[9]、天麻[10]等植物体内多糖的研究比较多。石豆兰的研究相对较少，仅对其资源调查[1]、显微结构特征[11]、非多糖化学成分的分离鉴定[12]、药理[13]等几个方面有少量研究，关于石豆兰多糖的研究尚未见报道。

植物多糖的提取多采用水提法。赵会然等[14]对云南产的五种兰科植物滇西贝母兰(Coelogynecalcicola)；喉红石斛(Dendrobiumchristyanum)；密花毛兰(Erispicata)；镰翅羊耳蒜 (Liparisbootanensis)；温氏卷瓣兰 (Bulbophyllumwendlandianum)中的多糖采用传统水提法，苯酚-硫酸法检测，方法稳定、重复性好，并优化了温度、料液比和提取时间等工艺参数。因此本研究采用水溶剂提取、苯酚硫酸法检测，在单因素试验的基础上进行正交设计，考察液料比、提取温度和时间及沉淀多糖的乙醇浓度对多糖提取量的影响。并对广东石豆兰粗多糖的总还原力、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率、Fe2+螯合率进行测定，评价其抗氧化活性。旨在为石豆兰功能性食品开发和利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石豆兰鲜样，经形态学鉴定属于广东石豆兰(Bublophyllumkwangtungense)，采自福建屏南鸳鸯猕猴自然保护区。

浓H2SO4、苯酚、葡萄糖、氯仿、异戊醇、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3、L-抗坏血酸、甲醇、乙醇、DPPH、FeSO4、水杨酸、H2O2、Tris、浓HCl、邻苯三酚、菲啰嗪、EDTA。

1.2 仪器

DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司)、QE-100中草药粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)、水浴锅(上海司乐仪器有限公司)、R205B旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)、ThermoHeraeus Multifuge X1R冷冻离心机、FD-ID-80冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖提取工艺流程

鳞茎洗净、切片、50 ℃烘干 → 粉碎过60目筛 → 干粉 → 热水浸提液 → 离心、取上清液 → 浓缩 → 低温醇沉过夜 → 沉淀溶解 → Sevage法去蛋白 → 多糖溶液→冷冻干燥 → 粗多糖。

1.3.2 多糖含量的测定

表1 标准曲线的绘制

采用赵会然的苯酚—硫酸法[14]，体系略作改动，具体见表1，490 nm处测其吸光度值，绘制标准曲线得回归方程A=0.01C-0.029，R2=0.996 4。

样品液按上面步骤得糖浓度，按下式计算多糖提取量：

多糖提取量(mg/g)=(C×V×N)/1 000M

式中：C—多糖浓度(μg/mL)，V—提取液总体积(mL)，N—稀释倍数，M—干粉重量(g)。

1.3.3 单因素试验

准确称取干粉1.0 g，分别考察液料比、提取温度、提取时间和醇沉浓度4个因素对多糖提取的影响，每个实验重复三次。

1.3.3.1 液料比的选择

按液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1加入蒸馏水，80 ℃水浴提取3 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.2 提取温度的选择

按液料比60∶1加入蒸馏水，分别在60、70、80、90、100 ℃下水浴提取3 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.3 提取时间的选择

按液料比60∶1加入蒸馏水， 90 ℃下水浴提取2、3、4、5、6、7 h，80%乙醇沉淀多糖。

1.3.3.4 醇沉浓度的选择

按液料比60∶1加入蒸馏水， 90 ℃下提取6 h得多糖提取液，加入乙醇使终浓度分别达到70%、75%、80%、85%、90%、95%，冰箱沉淀过夜。

1.3.4 多糖提取的正交试验

据单因素试验结果，选择液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C )、醇沉浓度(D)合适水平，以多糖提取量为指标，进行L9(34)正交试验设计，对多糖的提取工艺进行优化，确定最佳工艺条件。

表2 L9(34)正交试验因素与水平

1.3.5 换算因子的计算

醇沉、离心后得到的湿多糖经冷冻干燥，得干品，配成1 mg/mL的多糖原液，稀释成100 μg/mL，按标准曲线操作步骤得葡萄糖浓度，按下列公式计算换算因素：F=C0/C1。

C1—按方程得出的葡萄糖浓度；C0—配制的多糖浓度。经计算得：F=100 μg/mL/36.73 μg/mL=2.72

1.3.6 抗氧化活性的测定

配制100 mg/mL的广东石豆兰多糖溶液，稀释成100、200、300、400、500 μg/mL五个浓度梯度(编号1～5)，通过五个指标对石豆兰多糖抗氧化活性进行评价。

1.3.6.1 总还原力测定

还原力测定参考Apati等的方法[15]，略作调整。取1～5号样品液1 mL于试管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS(pH6.6)和1%铁氰化钾， 50 ℃水浴20 min，取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，摇匀、离心，吸取3.5 mL上清液加入新试管中，再加0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液摇匀，静置4 min，测700 nm吸光度值；以相同浓度的L-抗坏血酸做阳性对照。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除测定参考Hatano等的方法[16]，略作调整。各试管中分别加入1～5号样品液2.0 mL，再依次加2 mL的DPPH(0.2 mmol/L)，暗反应30 min，测定517 nm的吸光度值，记A1；用甲醇代替DPPH测定样品的本底吸收，记A2；用蒸馏水代替样品作空白对照，记A0；L-抗坏血酸做阳性对照，浓度梯度为样品的1/10(编号1-5)，平行3次，计算清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.6.3 羟基自由基清除能力测定

各管中分加入1～5号样品液1.0 mL，再加 9 mmol/L FeSO41 mL，反应15 min后加9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O21 mL，37 ℃反应30 min，测510 nm的吸光度值，记A1；用蒸馏水代替H2O2测定样品的本底吸收值，记A2；以蒸馏水代替样品，记A0；相同浓度的L-抗坏血酸做阳性对照；平行3次，计算清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.6.4 超氧阴离子清除能力测定

各管中分加入1～5号样品液1.0 mL，再分别加50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)3 mL，37 ℃水浴20 min，立即加37 ℃预热的7 mmol/L邻苯三酚1 mL，迅速摇匀倒入比色皿，325 nm处每30 s测吸光度值，连测4 min，计算每分钟变化值，记A1；蒸馏水代替样品，增加值记A0；以1/4样品浓度的L-抗坏血酸为阳性对照(编号1-5)；平行3次，计算清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

1.3.6.5 Fe2+螯合率测定

各管中分加入1～5号样品液1.0 mL，加0.1 mL 1 mmol/L 的FeSO4摇匀，静止15 min，加入0.2 mL 菲啰嗪(2.5 mmol/L)、3.7 mL蒸馏水，室温放置20 min，562 nm处测吸光值，记A1；用蒸馏水代替菲啰嗪，记A2；蒸馏水代替样品，记A0； 以1/10样品浓度的EDTA做阳性对照(编号1-5)；平行3次，计算Fe2+螯合率 (%)=[1-(A1-A2)/A0] ×100。

1.3.7 数据处理

数据分析用Excel2010和SPSS19.0，绘图采用Origin2018软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对多糖提取量的影响

从图1看出，多糖提取量随液料比增大呈先升后降趋势，在液料比20∶1时，多糖提取量仅为25.10 mg/g，多糖得率随液料比增大迅速增加，增加到60∶1时最高(65.40 mg/g)，主要是大的溶剂量增加了物料与溶剂的接触面积、溶液传质推动力和浓度梯度，促使细胞壁破裂，多糖得以释放。当超过60∶1时，多糖提取率出现缓慢下降趋势，可能是多糖溶出已达饱和，增加溶剂量，不仅消耗能源，且后续纯化浓缩难度增加，导致多糖的损失增大。综合考虑，选择液料比60∶1(mL/g)更为合适。

图1 液料比对多糖提取量的影响Fig.1 Effect of liquid-to-solid on polysaccharide yield

2.1.2 提取温度对多糖提取量的影响

从图2看出，60～90 ℃范围内，多糖浸提量逐渐升高，可能是因为高温加快了溶剂的渗透和溶质的扩散，利于多糖的溶出，90 ℃时提取量最高(69.92 mg/g)；但随着温度继续升高，多糖提取量反而下降，可能由于过高的温度加大了蛋白质凝固使多糖不易溶出，或者部分多糖发生了水解，又增加了杂质的溶出量。因此，温度以90 ℃为最佳。

图2 提取温度对多糖提取量的影响Fig.2 Effect of extracting temperature on polysaccharide yield

2.1.3 提取时间对多糖浸提量的影响

由图3得知，多糖提取量随着时间延长而升高，5 h后迅速增加，6 h时最高(74.99 mg/g)；时间过长不利于多糖的提取，可能是因为提取早期多糖的扩散速率逐渐增大，随着溶质在两相中浓度梯度差减小，扩散速度会越来越慢，待达到饱和后，多糖含量不再增加，如果继续加热提取，多糖会发生缩合、降解、氧化等化学反应，此外原料中的凝固蛋白质也不利于多糖的溶出，最终导致多糖得率下降。因此，提取时间6 h为宜。

图3 提取时间对总黄酮浸提量的影响Fig.3 Effects of extracting time on polysaccharide yield

2.1.4 醇沉浓度对多糖提取量的影响

从图4看出，随着沉淀多糖所用乙醇浓度的提高，多糖得率逐渐升高，当乙醇浓度超过80%时，多糖得率增加缓慢，95%醇浓度沉淀出的多糖比90%醇浓度只增加了3.19%，因此，选择90%～95%的乙醇浓度沉淀石豆兰多糖均能得到理想结果。

图4 醇沉浓度对多糖提取量的影响Fig.4 Effect of the alcohol concentration on polysaccharide yield

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果与分析

根据表3中R值大小可知，对多糖提取率的影响程度依次为：提取时间>提取温度>醇沉浓度>液料比，最佳提取工艺为A1B2C2D3，即液料比为50∶1(mL/g)，温度为90 ℃，时间为6 h，醇沉浓度为95%。方差分析结果(表4)显示，四个因素的F值均大于F0.01，说明四个因素对多糖提取率的影响都达到了极显著水平。

表3 L9(34)正交试验结果

表4 方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00。

Note：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00.

2.2.2 最优工艺的验证性

按照正交设计优化出的最佳工艺条件A1B2C2D3进行提取，平行三次，结果见表5，多糖平均提取率为79.060 mg/g，RSD 值为0.132%(n=3)。计算结果表明，该提取工艺稳定可行。

2.3 多糖的抗氧化性

2.3.1 总还原力

以L-抗坏血酸为对照，测定广东石豆兰多糖的总还原力，结果见图5。总还原力随多糖浓度增加而升高，但低于同浓度的L-抗坏血酸，还原力为0.5对应的多糖和L-抗坏血酸质量浓度A0.5分别是5 061、174.87 μg/mL，其还原力为L-抗坏血酸的3.46%。总还原力是反映潜在抗氧化活性的重要指标，由此可见广东石豆兰多糖的还原力较小。

表5 验证性试验

图5 多糖的总还原力Fig.5 Total reducing power of polysaccharide

2.3.2 对DPPH自由基的清除能力

多糖和L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力如图6所示，随着浓度的升高，清除率都呈上升趋势，但多糖上升缓慢，500 μg/mL比100 μg/mL的多糖对DPPH自由基清除率只提高了26.44%，大大

图6 多糖对DPPH自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacity to DPPH free radical of polysaccharide

低于阳性对照，多糖和L-抗坏血酸对DPPH自由基清除率达到50%时所需的效应浓度(EC50)分别为2769.58、18.80 μg/mL，得出多糖清除DPPH自由基的能力是L-抗坏血酸0.68%。

2.3.3 对羟基自由基的清除能力

多糖对羟基自由基清除能力如图7所示，随浓度增大，清除能力逐渐增强，基本呈线性增长；多糖和L-抗坏血酸对羟基自由基的EC50分别为 594.60、280.49 μg/mL，得出多糖清除羟基自由基的能力是L-抗坏血酸的47.17%。

图7 多糖对羟基自由基的清除效果Fig.7 Scavenging capacity to hydroxy free radical of polysaccharide

2.3.4 对超氧阴离子清除能力

多糖对超氧阴离子清除能力如图8所示，随着浓度的增大，清除率逐渐提高，多糖的清除率稍高于1/4相同浓度的L-抗坏血酸的清除率，多糖和L-抗坏血酸对超氧阴离子的EC50分别为 586.94、170.20 μg/mL，得出多糖对超氧阴离子的清除能力是L-抗坏血酸的29.00%。

2.3.5 对Fe2+的螯合能力

如图9所示，多糖对Fe2+有一定的螯合能力，随着浓度升高，对Fe2+的螯合能力逐渐增强，当浓度达到300 μg/mL后，螯合能力上升减缓；所试的浓度范围内，多糖的螯合率低于1/10相同浓度EDTA的螯合率；多糖和EDTA对的Fe2+的螯合率EC50分别为 160.83、3.41 μg/mL，得出多糖对Fe2+的螯合力是EDTA的2.12%。

图8 多糖对超氧阴离子的清除效果Fig.8 Scavenging capacity to superoxide anion of polysaccharide

图9 多糖对Fe2+的螯合率Fig.9 Chelating rate to Fe2+ of polysaccharide

3 结论

本试验在参考前人研究基础上选用热水法提取石豆兰多糖，采用单因素结合正交试验设计，四个因素对多糖的提取率的影响依次为提取时间>提取温度>醇沉浓度>液料比，正交试验优化出的最佳工艺为A1B2C2D3，即液料比为50∶1(mL/g)，提物温度为90 ℃，提取时间为6 h，醇沉浓度为95%，此工艺下，多糖的提取量为79.060 mg/g，RSD值为0.132%。

石豆兰多糖具有一定的抗氧化能力，总还原力为L-抗坏血酸的3.46%；清除DPPH自由基的能力较弱，清除羟基自由基和超氧阴离子的能力相对较强，清除能力分别是L-抗坏血酸的0.68%、47.17%和29.00%；对Fe2+的螯合能力是EDTA的2.12%。