苦橙叶精油化学成分及抗炎作用研究

叶一丹，张 楠，李玉红，姚 雷*

1上海交通大学农业与生物学院；2上海交通大学设计学院，上海 200240

苦橙(CitrusaurantiumL.subspeciesamaraL.)，芸香科柑橘属，近20年来被广泛用于保健食品中，南美民间也常将其用于治疗失眠、焦虑和癫痫。中医临床中主要将其制备成枳壳或枳实，治疗消化不良、腹泻和痢疾等[1]。其提取物具有抗氧化、抗肥胖及抗癌等作用[2-4]，相关研究表明苦橙果实中的黄酮类化合物也具有一定的抗炎能力[5]，苦橙皮中提取的川陈皮素抗炎作用体现在调节NF-κB信号通路中环氧合酶-2(COX-2)，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)以及促炎因子等的表达[6]。

苦橙的果实、花、果皮被广泛用于提取精油，有文献报道来源于这三个部位的精油具有抗菌、抗焦虑、抗炎等功效[7-9]。但是目前对于苦橙叶的开发利用较少，鲜见对其精油的功效报道。本文对苦橙叶精油进行了化学成分分析，通过细胞及动物模型评价了其抗炎活性以期为苦橙叶的抗炎研究及开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

HF151二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；SHJ 系列洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；L550 湘仪离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Multiskan Go全波长酶标仪，上海赛默飞仪器有限公司；TE1502S 电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；CU-600 电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，美国安捷伦公司。

1.2 试剂与材料

小鼠腹腔巨噬细胞(RAW 264.7)，购自中科院上海细胞库；ICR小鼠，由上海交通大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(沪)2013-0050，4～6周鼠龄，实验前适应性饲养1周，自由饮水进食；苦橙叶精油、薰衣草(Lavandulaangustifolia)精油、荷荷巴(Sismondiachinensis)油由上海交通大学芳香植物研究中心提供；复方醋酸地塞米松乳膏，来源于浙江仙琚制药股份有限公司；RPMI 1640培养基，来源于美国HyClone公司；胎牛血清，来源于Gibco公司；脂多糖(LPS)、二甲基亚砜(DMSO)，来源于美国Sigma公司；CCK-8试剂盒，购自东仁化学科技有限公司；一氧化氮(NO)试剂盒，购自碧云天生物公司。

2 实验方法

2.1 苦橙叶精油成分分析

采用GC-MS对苦橙叶精油进行成分分析。气相条件：色谱柱：HP-5 ms(28.76 m×250 m×0.25 μm)，进样温度：270 ℃，柱温50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至240 ℃保持5 min，共运行60 min，载气He，流速1.0 mL/min，进样量1 μL，分流比30∶1。质谱条件：电离方式：EI+，70 eV；检测器电压：2 047 V；溶剂延迟：3 min；质量扫描范围m/z：33～500全扫描。

2.2 RAW 264.7细胞培养

用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)培养细胞，并置于37 ℃，5% CO2二氧化碳培养箱中，待细胞密度达到80%～90%，用不含EDTA胰酶进行细胞消化，以1∶3传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.3 RAW 264.7细胞活性的测定

采用CCK-8法检测苦橙叶精油对RAW 264.7细胞活性的影响。调节细胞密度至3×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，待细胞贴壁后，加入不同浓度的苦橙叶精油(0.1、1、10、50、100、200、500 μg/mL)为实验孔，并设调零孔(仅培养基)和空白对照组(培养基+细胞)，每组6个复孔，培养24 h后吸上清，加入CCK-8试剂继续培养1 h，于450 nm处测定各孔OD值。

细胞存活率(%)=(实验孔﹣调零孔)/(对照孔﹣调零孔)× 100%

2.4 LPS诱导RAW 264.7细胞及致炎浓度确定

取对数生长期的RAW 264.7细胞，调节细胞密度为3×105个/mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，待细胞贴壁后加入LPS刺激，刺激浓度为0.01、0.1、0.5、1、5 μg/mL，并设调零孔、空白对照组，每组设置4个复孔。24 h后用Griess试剂检测细胞上清液，根据NaNO2的标准曲线计算NO含量。

2.5 苦橙叶精油作用下RAW 264.7细胞分泌NO含量的测定

取对数生长期的RAW 264.7细胞，调节细胞密度为3×105个/mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，培养24 h后，加入不同浓度的苦橙叶精油使终浓度为1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，1 h后加入1 μg/mL的LPS进行刺激，继续培养24 h后，检测各孔吸光度值，根据标准曲线计算各组NO浓度。

2.6 苦橙叶精油抗炎作用动物模型检测

2.6.1 实验分组

本实验中拟采用两种阳性药物。阳性对照一为复方醋酸地塞米松乳膏，此为常见的抗炎涂抹药物。阳性对照二为薰衣草精油，有文献报道薰衣草精油具有良好的抗炎活性[10]。本实验所用精油均采用荷荷巴油作为基础油进行配制，故设置对照荷荷巴油组，并设立空白组、模型组、苦橙叶精油低浓度(1%,v/v)组、苦橙叶精油中浓度(5%,v/v)组、苦橙叶精油高浓度(10%,v/v)组，共8组。

2.6.2 巴豆油致小鼠耳肿胀实验

选取48只雄性ICR小鼠(体重20 ± 2 g)，按照上述分组方式随机分为8组，地塞米松组按照0.05 mg/ear涂抹，根据文献选择阳性对照薰衣草精油组浓度为5%(v/v)，苦橙叶精油按1%、5%、10%的浓度分为低、中、高浓度组，各组分别于小鼠右耳正反面均匀涂抹对应药物20 μL，连续给药7天，每天一次，空白组不做任何处理。末次给药后1 h，将致炎剂20 μL(巴豆油：无水乙醚：无水乙醇：蒸馏水=2∶73∶20∶5)均匀涂抹于各组小鼠右耳廓内外两面致炎，左耳对照不做任何处理。2 h后处死小鼠，剪下小鼠双耳，用直径6 mm打孔器在左右耳对称部分打下耳片，称重计算其肿胀度和肿胀率，肿胀率(%)=(右耳重量-左耳重量)/左耳重量 × 100%，并将部分耳片制作组织切片，在光镜下观察各组耳片组织变化。

2.6.3 鸡蛋清致小鼠足肿胀实验

选取48只雄性ICR小鼠(体重20 ± 2 g)，按照上述分组方式随机分为8组，地塞米松按浓度0.1 mg/只，薰衣草组浓度为5%(v/v)，苦橙叶精油低、中、高浓度组浓度为1%、5%、10%，各组分别于小鼠右足跖正反面均匀涂抹对应药物30 μL，连续给药7天，每天一次，空白组不做任何处理。末次给药后1 h，将自制10%蛋清25 μL注射于小鼠足跖皮下致炎，分别在0.5、1.5、3、4 h后用游标卡尺测量小鼠左右足跖厚度，计算小鼠足跖肿胀率，肿胀率(%)=(右足跖厚度-左足跖厚度)/左足跖厚度×100%。

2.7 HE染色切片观察

将小鼠耳片用10%(v/v)的福尔马林溶液固定，脱水后石蜡包埋、切片，进行HE染色，光学显微镜下拍片，观察小鼠耳肿胀程度和炎症细胞浸润情况。

2.8 统计学分析

实验数据均采用SPSS 20.0统计软件分析，用单因素方差齐性检验，Duncan检验多重比较显著性，P<0.05时差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 苦橙叶精油化学成分分析

采用GC-MS方法共检测到苦橙叶精油20种主要成分，如表1所示，分别为α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、月桂烯、对伞花烃、柠檬烯、(E)-β-罗勒烯、罗勒烯、萜品油烯、芳樟醇氧化物、芳樟醇、松油醇、橙花醇、乙酸芳樟酯、柠檬醛、乙酸松油酯、乙酸橙花酯、乙酸香叶酯、β-石竹烯和α-律草烯，其中酯类化合物占62.75%，醇类化合物占30.94%。含量最多的酯类和醇类化合物为乙酸芳樟酯和芳樟醇，两者相对含量分别为54.72%和22.98%。

3.2 苦橙叶精油对RAW 264.7细胞活性的影响

通过CCK-8实验来检测苦橙叶精油对细胞活性的影响。结果表明，与空白对照组相比，浓度为0.1、10、50、100 μg/mL的苦橙叶精油对细胞活性无显著影响，浓度为1 μg/mL的苦橙叶精油可以提高巨噬细胞活性，浓度为200、500 μg/mL的苦橙叶精油与空白组相比显著降低了细胞活性(P<0.05)。以上结果表明苦橙叶精油在0～100 μg/mL的浓度范围内不会显著抑制细胞活性。

图1 苦橙叶精油对RAW 264.7细胞活性的影响Fig.1 The effects of essential oil from leaves of Citrus aurantium L.subspecies amara L.on cell proliferation rate of RAW 264.7 macrophages cells注：图中不同字母表示各浓度苦橙叶精油对RAW 264.7细胞活性具有显著性差异(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

图2 不同浓度LPS对RAW 264.7细胞释放NO的影响Fig.2 Effect of LPS on RAW 264.7 macrophages cells release NO注：图中不同字母表示各浓度LPS作用下对RAW 264.7细胞NO释放量具有显著性差异(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

3.3 LPS诱导RAW 264.7细胞致炎及致炎浓度的确定

与空白对照组相比，不同浓度LPS处理细胞后，其NO释放量显著增多，并且呈浓度依赖性(图2)。1 μg/mL的LPS刺激细胞产生14.1 mmol/L的NO，为空白组4.9倍(P<0.05)。基于对细胞状态的考虑，后续实验选用浓度为1 μg/mL的LPS浓度进行细胞刺激。

3.4 苦橙叶精油对RAW 264.7细胞分泌NO的影响

采用Griess法检测不同浓度苦橙叶精油对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放量的影响。结果表明25、50、100 μg/mL苦橙叶精油均能显著降低RAW 264.7细胞NO释放量(P<0.05)(图3)，其中25 μg/mL精油浓度处理下NO释放量最少，表明该浓度苦橙叶精油具有较好的抗炎效果。

图3 苦橙叶精油对RAW 264.7细胞释放NO的影响Fig.3 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L. subspecies amara L.on RAW 264.7 macrophages cells release NO注：图中不同字母表示各浓度苦橙叶精油对LPS刺激RAW 264.7细胞NO释放量具有显著性差异(P <0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

3.5 苦橙叶精油对巴豆油致小鼠耳肿胀模型影响及组织形态学分析

巴豆油诱导小鼠耳肿胀模型中，在巴豆油诱导后20 min内小鼠耳朵出现红肿现象，并在2～3 h内达到最大肿胀度。实验结果表明，对照处理与模型组相比不会影响小鼠的耳肿胀程度。与空白组相比，各组耳肿胀明显(P<0.05)，与模型组相比，地塞米松和薰衣草精油这两种阳性药物及中(5%)、高浓度(10%)苦橙叶精油对于巴豆油所致小鼠耳肿胀均有显著抑制作用(P<0.05)，其中中浓度苦橙叶精油肿胀抑制率最高。

从图5 HE染色结果可以看出，与空白对照组小鼠耳组织相比，涂抹了巴豆油的模型组及对照组小鼠耳组织有明显的水肿和淋巴细胞浸润现象，造模成功。并且地塞米松组、薰衣草油组及苦橙叶中、高浓度组能明显地减轻巴豆油诱导的小鼠耳水肿和淋巴细胞浸润现象。

3.6 苦橙叶精油对鸡蛋清致小鼠足肿胀模型的影响

如图6所示，模型组小鼠在造模后足跖肿胀明显，于造模后1.5 h左右肿胀度达到高峰，并于4 h后缓慢恢复，各浓度苦橙叶精油均对小鼠足肿胀有一定抑制作用，并于肿胀前期呈浓度依赖性。总体上，高浓度苦橙叶精油前2 h抗炎效果最佳，且效果较阳性对照薰衣草组好，但其作用尚不及地塞米松组的作用强，且起效不及地塞米松快。造模3 h后，中浓度苦橙叶精油药效较低、高浓度苦橙叶精油组组好。

4 讨论

许多研究表明芳香植物精油的药用价值很高，具有抑菌、抗炎镇痛、抗病毒等生物活性[11-13]。但我国对精油植物资源的开发利用多限于香精香料及化妆品领域，仅少数用于医药等其他行业。

图4 苦橙叶精油对巴豆油致小鼠耳肿胀的影响Fig.4 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L. subspecies amara L. on edema of mouse ear induced by croton oil注：图中不同字母表示各浓度苦橙叶精油对小鼠耳肿胀率具有显著性差异(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

图5 巴豆油诱导的小鼠耳片(HE,×200)Fig.5 Histological sections of ear from croton oil treated mouse(HE,×200)注：A) 空白对照组;B) 模型组;C)对照组;D) 地塞米松组;E) 薰衣草油组;F) 苦橙叶油低浓度组;G) 苦橙叶油中浓度组;H) 苦橙叶油高浓度组。Note:A) Blank group;B) Model group;C) Control group;D) Dexamethasone group;E) Lavender oil group;F) Low concentration group;G) Middle concentration group;H) High concentration group.

炎症是多种疾病的基本病理过程，但过度的炎症会对机体产生不同程度的危害[14]，NO是动物体内极强的自由基，起到神经递质作用，并调节免疫系统[15]，细胞实验中常用此指标评价药物抗炎效果。本文通过对LPS致炎RAW 264.7细胞，研究苦橙叶精油作用下细胞活性和NO释放量，发现苦橙叶精油具有一定的体外抗炎活性，其体外抗炎作用可能与抑制NO等炎症介质的产生有关。

巴豆油致小鼠耳肿胀和鸡蛋清致小鼠足肿胀实验是常用的急性炎症模型，前者可改变血管通透性、刺激巨噬细胞、分泌促炎介质[16]。后者可使致炎局部的前列腺素合成增加，并引起炎症介质的释放等形成肿胀[17]。地塞米松常用来筛选抗炎药物[18]，其抗炎作用机制为减少COX-2的表达，抑制前列腺素产生和巨噬细胞的活动等[19]。薰衣草精油可通过抑制促炎因子及自由基等的释放发挥抗炎作用[20]。在实验中，通过涂抹给药方式，发现中、高浓度苦橙叶精油对巴豆油所致的小鼠耳肿胀均有显著抑制作用并可改善组织水肿，但高浓度精油效果不及中浓度，可能由于中浓度比高浓度苦橙叶精油更温和地发挥抗炎作用。低、中、高浓度组对小鼠足肿胀均有不同程度抑制作用，在致炎后1～3 h之间作用明显，说明苦橙叶精油具有一定的抗急性炎症作用，并且实验结果与两种阳性药物有相同的作用趋势，且GC-MS结果表明，苦橙叶精油中含有的乙酸芳樟酯和芳樟醇占总相对含量的77.69%，薰衣草精油也含有大量乙酸芳樟酯和芳樟醇，由此推测其主要的抗炎的作用机制可能与薰衣草精油类似。

图6 苦橙叶精油对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响Fig.6 Effect of essential oil from leaves of Citrus aurantium L.subspecies amara L. on edema of mouse paw induced by egg-white注：图中在同一时间点中不同字母表示各浓度苦橙叶精油对小鼠足肿胀率具有显著性差异(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant difference between each group (P<0.05).

苦橙叶精油开发成本低，本研究证明苦橙叶精油具有一定体外和体内抗炎作用，为之后进一步深入探究苦橙叶精油抗炎作用机制提供了科学理论依据，为合理且有效地开发苦橙精油提供了研究基础。