基于NGS-SNP分型和IBS策略进行全同胞关系鉴定

王致远，王迪佳，李燃，李海霞，汪娜娜，孙宏钰

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 510089；2.佛山市公安局，广东 佛山 528000；3.深圳市公安局龙华分局，广东 深圳 518109）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）具有突变率低（仅为STR的十万分之一）、扩增片段短、数量丰富等特点，被称为第三代遗传标记[1-3]。但是，由于单个SNP位点通常只有两个等位基因，多态性较STR相对低，因此要检测更多的SNP位点才能达到法医学个体识别和亲子鉴定的检测需求。SANCHEZ等[4-5]基于传统的毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术开发了包含52个SNP位点的SNPforID检测体系，研究结果显示，其可以应用于个体识别，但是仍然难以满足亲缘关系分析的要求。

近年来，大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS）技 术 ，又 称 为 高 通 量 测 序（highthroughput sequencing，HTS）技术或下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术，发展迅速，能够同步检测的遗传数目增多，检测成本降低[6-7]。本课题组前期基于Ion TorrentTM平台的HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel分型体系，探索了90个常染色体SNP位点在广东汉族群体的多态性[8]，本研究拟基于状态一致性（identity by state，IBS）分析策略，探索这90个SNP位点在全同胞关系分析中的效能。

1 材料与方法

1.1 样本收集和DNA提取

在知情同意原则下，采集中国汉族一个四代家系共35个成员的血样，个体之间关系如图1所示。使用AutoMateExpressTMForensic DNA Extraction System（美国Thermo Fisher Scientific公司）提取DNA，并使用 QubitTMdsDNA HS Assay Kit（美国 Thermo Fisher Scientific公司）在QubitTM3.0荧光定量仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行DNA定量。另外，根据本课题组前期研究中的无关个体SNP分型数据[8]随机组合获得1000对无关个体（unrelated individual，UI）。

图1 本研究对象的四代家系系谱图

1.2 常染色体STR分型

采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统25A［基点认知技术（北京）公司］对23个常染色体STR基因座进行扩增，在3500xL基因分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行检测，并使用GeneMapper®ID-Xv1.5软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行STR分型。

1.3 常染色体SNP分型

采用Precision ID Identity Panel（美国Thermo Fisher Scientific公司）和Ion AmpliSeqTMLibrary Kit（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行文库构建[8]。该检测体系可同时检测90个常染色体身份信息SNP（identity informative SNP，iiSNP）以及34个Y-SNP位点。扩增产物使用Ion ChefTMSystem（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行自动化模板制备，应用Ion 520TM或 Ion 530TMKit（美 国 Thermo Fisher Scientific公司）在Ion S5TMXL System（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行测序。测序结果采用Torrent SuiteTMv5.2.2软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行分析，同时结合HID SNP Genotyper Plugin v4.3.1软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行SNP分型。

1.4 数据分析

对于家系中的所有父-母-子关系，根据23个常染色体STR的分型结果，计算亲权指数（paternity index，PI），依照行业技术规范[9]，如果累积亲权指数（combined paternity index，CPI）大于10000，则支持他们之间的亲子关系。基于该家系共获得全同胞（full sibling，FS）、祖孙（grandparent-grandchild，GG）、叔侄（姨甥）（uncle/aunt-nephew/niece，UN）和第一代堂表亲（first cousin，FC）共4种亲缘关系类型。参考《生物学全同胞鉴定实施规范》[10]，分别计算各种关系类型的IBS评分，采用R语言绘制各关系类型的IBS分布图[11]。采用Wilcoxon秩和检验比较全同胞与其他亲缘关系类型IBS评分分布的差异，检验水准α=0.05。采用SPSS 20.0软件建立各种关系的Fisher判别函数[12]。以待鉴定个体对的IBS评分作为判别因子（S），分别代入相应的判别函数获得判别评分L值，并将该对个体的关系类型归为L值较大的组别。同时，基于前期研究获得的频率数据[8]，分别模拟10 000对4种亲缘关系和无关个体样本对。参考《生物学全同胞关系鉴定实施规范》[10]，对于待鉴定个体对，如果其IBS评分小于或等于某一阈值（下限值t1），则判定为无关个体；如果大于或等于另一阈值（上限值t2），则判定为对应亲缘关系；如果在t1和t2之间，则无法判定。基于此设定探索错判率分别为≤0.01%、≤0.05%、≤0.1%、≤0.5%和≤1%时的判定阈值以及相应的系统效能。

2 结 果

2.1 SNP测序概况

对于该家系的35个样本共进行了3批测序，装载（chip loading）比例分别为62%、70%、73%，富集率（enrichment）分别为93%、95%、95%，单克隆（monoclonal）比例分别为64%、67%、67%，总计获得超过1 400万条序列（reads）。35个样本在90个SNP位点均获得完整分型，分型率为100%。

2.2 家系成员关系确认

根据23个常染色体STR分型结果对本研究四代家系中所有的父-母-子关系进行了确认，基于该家系样本可获得的亲缘关系类型及数量如表1所示。

表1 本研究四代家系样本的关系类型及数量

2.3 各类亲缘关系的IBS评分分布

基于该90个SNP分型结果，在256对亲缘关系中，全同胞的平均IBS评分最高（IBS=148），第一代堂表亲的平均IBS评分最低（IBS=124）。祖孙、叔侄（姨甥）的平均IBS分值分别为130、132。相比之下，无关个体的IBS评分最低，平均仅为120。各种关系类型的IBS分布情况如图2所示。

经Wilcoxon秩和检验，除了祖孙与叔侄（姨甥）的IBS评分差异无统计学意义（P=0.719）外，其余关系类型之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图2 5种关系类型基于90个SNP分型的IBS分布

2.4 Fisher判别函数法进行亲缘关系判定

通过Fisher判别函数进行4种亲缘关系的判定，结果见表2。其中，全同胞关系全部被正确评判为相应的亲缘关系，对于更远的亲缘关系，错判率显著升高。综合考虑无关个体的判定结果，判别函数法对全同胞关系判定的准确率最高（98.7%），对第一代堂表亲判定的准确率最低（61.3%）。

表2 基于90个SNP分型建立的4种关系判别函数及分析结果

2.5 IBS阈值法进行亲缘关系判定

基于前期研究，本研究模拟了10000对4种亲缘关系和无关个体样本，全同胞的IBS分布情况见图3。

参考《生物学全同胞关系鉴定实施规范》[10]，本研究计算了在不同错判率下各类亲缘关系IBS评分的判定阈值及相应的系统效能，结果见表3。

从表3可以看出，在相同错判率下，全同胞关系鉴定的系统效能最高，第一代堂表亲关系鉴定效能最低。

图3 基于90个SNP分型的全同胞IBS分布

表3 基于90个SNP分型建立的各种亲缘关系IBS判定阈值及系统效能

另外，可根据此表灵活选择判定阈值。以全同胞关系为例，当设定错判率≤0.05%时，如果某对样本IBS评分≤128，则判定为无关个体，如果≥141，则判定为全同胞，相应的系统效能为0.8814，即88.14%的案例可以获得明确的鉴定意见。

3 讨 论

目前，国内司法系统使用的《生物学全同胞关系鉴定实施规范》基于STR分型结果，采用IBS评分法提出判断全同胞、无法判断、无关个体的标准和检测效能[10]。相对于似然比（likelihood ratio）法，IBS评分法无需考虑等位基因频率，只需要根据等位基因共享情况即可进行亲缘关系判定，具有分析直观、简单、快速的优势[11，13-15]。另一方面，对于特殊案例，如高度腐败或者降解检材，常常无法获得完整STR分型，而SNP由于扩增片段短可以获得完整分型。并且随着NGSSNP分型体系的日益成熟，将越来越广泛地应用于法医学个体识别和亲缘鉴定[16]，因此本研究采用Precision ID Identity Panel分型体系对90个SNP位点进行分型，结合IBS策略探索了该检测体系在全同胞关系鉴定中的应用价值。

本研究结果显示，全同胞、祖孙、叔侄（姨甥）和第一代堂表亲4种亲缘关系中，除了祖孙与叔侄（姨甥）关系外，其余关系类型的IBS评分差异均有统计学意义，且均高于无关个体。祖孙与叔侄（姨甥）的IBS评分无显著差异，可解释为这两类亲缘关系同属于二级亲缘关系，理论上他们之间均共有四分之一的亲代遗传物质。另外，随着亲缘关系的疏远，IBS分值逐渐降低。亲缘关系中的第一代堂表亲与无关个体的IBS差异最小。

本研究根据90个SNP分型数据建立了4种亲缘关系的Fisher判别函数，综合无关个体的判定结果后对全同胞关系的错判率为1.3%，低于赵书民等[12]研究中的2.98%。分析原因为本研究包含的90个SNP位点相当于22个STR基因座的多态性[17]，多于赵书民等研究中采用的Identifiler系统STR数目（15个STR）。但是，对于其他较远亲缘关系的错判率较高，尚不能满足实践需求。

此外，由于判别函数法具有“是”或者“否”的二分类特征，不存在无法判定的“灰色区域”，系统效能高，但是错判率相对也较高。本研究采用判别函数法进行全同胞关系的错判率为1.3%，显著高于根据《生物学全同胞关系鉴定实施规范》及赵书民等[12-13]研究采用19个STR和IBS阈值法（t1=13，t2=22）的错判率（≤0.05%）。本研究基于前期获得的频率数据，模拟了10000对各种亲缘关系和无关个体，获得了相应的IBS判定阈值。结果表明，当错判率低至0.05%时，进行全同胞鉴定的系统效能为0.881 4，高于采用19个STR时的效能（0.75）[10]，提示这90个SNP可以应用于全同胞关系鉴定。因此，当采用这90个SNP进行鉴定时，推荐使用对应的阈值t1=128、t2=141作为全同胞的判定标准。如果允许的错判率提高，相应的系统效能更大。实际工作中可以根据需要，选择不同的标准和阈值进行判定，这也显示了IBS阈值法的灵活性。

值得一提的是，检测体系包含的SNP位点数目越多，对于各类亲缘关系鉴定的鉴别能力以及准确率越高。KLING等[18-19]应用高密度SNP芯片技术检测了超过90万个SNP位点，以共有等位基因数目作为判定参数，发现可以区分至第二代堂兄弟（姐妹）的关系。这也显示了SNP遗传标记和IBS策略在亲缘关系鉴定中的应用潜力，本研究下一步拟基于更大数量的实验样本和实际案例进行验证。