结核病实验室检测技术的研究进展

罗 风，李晓非，丁彩梅

(昆明市第三人民医院检验科，昆明650041)

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)复合群为结核病的病原菌，导致人患肺结核的致病菌90%以上为MTB，该菌主要通过飞沫传播，通过消化道及损伤皮肤等途径感染机体也偶有报道[1]。结核病的致死率高于获得性免疫缺陷综合征，在全世界范围内其病死率居传染性疾病排行榜第一位，据统计2016年全球估计有1 040万新发结核病患者，10%为新患结核病的儿童，130万结核病患者死亡，其中20万儿童结核病患者死亡,且儿童结核病大部分是由患活动性肺结核的成人患者传染而得；同时提出我国耐多药结核病负担居世界第二位，2016年耐药结核病占新增结核病的4.1%[2-5]。当前我国结核病防治现状形势严峻，结核病患病人口基数大，病例发现率低，常被误诊及延迟治疗，主要是由于临床上缺乏针对结核病准确、快速、简便的实验室检测及病情监测技术[5-9]。现对近年来国内外各项结核病实验室检测技术的优缺点及临床应用范围进行归纳，总结该领域当前研究的热点及难点，以期为临床结核病早期精准诊治及病情监测探索更实用的实验室检测技术。

1 细菌学检测技术

结核病诊断的金标准为MTB细菌学检查阳性；MTB细菌学检查方法包括细菌涂片显微镜检测技术和细菌分离培养技术，由于其细菌学检查的阳性检出率不高，导致临床上结核病诊断出现大量的漏诊及误诊现象[2]。

1.1标本涂片方法 由于传统的直接涂片法不容易检出MTB，临床工作者不断进行各种浓缩集菌涂片法的尝试，以期提高MTB的检出率[10]。一项研究收集864份痰标本同时进行夹层杯离心集菌涂片法和传统涂片法检测MTB，结果前者检测的阳性率较后者高11.92%，且前者操作简便、易于标准化，说明前者是一种优于传统涂片法的检测方法[11]。李淑敏等[12]提出改良抗酸染色法与传统抗酸染色法相比检出率提高到88.57%，同时改良法可以检测到胞内杆菌；改良法是将传统法的试管离心改为玻片离心，然后triton破膜后行抗酸染色。李雪莲和高孟秋[13]提出应用玻片离心改良抗酸染色法，可将传统方法的检出率提高至61.7%。以上方法有效提高了涂片查找MTB的检出率。

1.2齐-尼(Ziehl-Neelsen)染色镜检法 Ziehl-Neelsen是目前国内外常用的抗酸染色法，染色后在普通光学显微镜下观察MTB菌体呈红色，背景呈蓝色。该法是临床上确诊肺结核的可靠方法，是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的结核病诊断方法之一，具有简单、快速和可靠等优点；该法的缺点是欠敏感，不能区分MTB与非MTB(欠特异)，在疾病的不同阶段诊断敏感性不同，无法分辨死菌与活菌，易受标本质量及检验人员技术水平的影响，结果阴性也不能排除结核病[7]。

1.3发光二极管荧光显微镜镜检法 发光二极管荧光显微镜镜检法是在荧光染色镜检法的基础上应运而生的，是继传统显微镜检查后的一大突破。WHO已推荐其逐步取代传统荧光显微镜，同时作为传统光学显微镜的替代技术[14]。与传统显微镜相比，发光二极管荧光显微镜更持久耐用，镜光柔和成本低，光路调节简单，不需要暗室环境同时极大提高了检测敏感性，同时其对检验人员的技术水平要求不高，基层医院人员只要经过培训熟练掌握后即可开展工作，目前该方法已在发达国家普遍推广[15-17]。但是发光二极管荧光显微镜检测MTB也存在与传统检测方法相同的弊端，即其无法区分MTB和非MTB、死菌和活菌。在发光二极管荧光显微镜的基础上又出现了自动化数字显微图像结核病检测技术系统，它是一种可以自动处理荧光显微图像以识别MTB同时报告检测结果的新技术，该系统可以提高对活动性结核病诊断的敏感性和特异性，其性能相当于一个经验丰富的MTB检验医师，缺点是有时仍需要人工阅片复检[18-19]。

2 分子生物学检测技术

尽管当前结核病实验室诊断技术不断进步，对调查结核病发病机制非常有利，但要分析这种缓慢生长病原体的基本基因功能以及为临床提供快速准确病原学检测结果仍非常困难[20]。分子生物学检测技术以其独特的优势正迅猛发展且逐步取代传统的MTB检测技术[21]。

2.1基因编辑技术——规律间隔的短回文重复序列干扰技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-interference，CRISPRi) CRISPRi技术自问世以来，在编辑真核和原核生物基因方面发挥着极大作用，同时成为研究MTB基因功能的新工具，有望成为一种稳定、易于设计和可扩展的调节基因沉默的平台[22]。CRISPRi系统抑制生物细胞靶基因表达的原因是Cas9-引导RNA复合体同与引导RNA互补的DNA结合，导致空间位阻的产生，以致终止RNA聚合酶的转录，最终结果是抑制靶基因的表达[23]。Choudhary等[24]在2015年成功构建了CRISPRi系统，该系统能高效抑制MTB基因表达；Singh等[25]在2016年成功运用CRISPRi系统实现了对MTB几个功能基因的表达抑制。由于CRISPRi系统中化脓性链球菌Cas9在MTB中较低的基因敲除效率和蛋白毒性，Rock等[26]对此问题进行深入研究发现嗜热链球菌Cas9的CRISPRi系统蛋白毒性最小同时其基因调控更精准。CRISPRi系统可用于MTB不同生长阶段，且能对多个功能基因同时进行表达调控，是一种高效率、广泛适用的基因编辑技术，期待该系统在MTB功能基因组学、遗传相互作用和药物靶标分析等方面发挥更大的作用[27]。

2.2利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术 MTB利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，GeneXpert MTB/RIF)是近年来MTB分子诊断方面的突破之一，是由Cepheid公司研发的全自动半定量巢式实时荧光定量检测技术，包括Xpert MTB/RIF检测试剂盒及“GeneXpert”聚合酶链反应平台，适用仪器为GeneXpert；该技术可从待测标本中检测出MTB复合群同时判断其耐药性(仅针对利福平)，引物和探针是依据单拷贝基因rpoB耐药决定区而设计，对操作人员的技术水平要求低，整个检测过程安全无污染在密闭环境进行，2 h即可出结果[28-29]。2016年Gürsoy等[30]为评价Xpert MTB/RIF实验在临床样本中检测MTB的诊断性能，采用Xpert MTB/RIF试验方法对2 160份标本(肺内标本1 141份，肺外标本1 019份)进行测试，结果显示其检测对于肺外标本、肺内标本及全部标本的灵敏度分别为63.9%、77.5%、73.3%，特异度分别为99.2%、99.5%、99.3%。该研究说明Xpert MTB/RIF技术对所有样本检测的特异度较高，虽然对肺外样本的敏感性处于中等水平，但也提示其对肺外结核的快速诊断有一定价值。余丽等[31]对Xpert MTB/RIF技术诊断MTB进行研究，发现其有很高的准确度，这与Gürsoy等[30]研究结果一致，同时该团队采用梯度浓度稀释法得出Xpert MTB/RIF技术检测MTB的最低检出限达300 CFU/mL，该数据与传统培养法基本相似，且得出在检测样本中MTB含量低于300 CFU/mL时，易出现利福平耐药假阳性的结果。由于儿童难以提供呼吸道标本，Banada等[32]利用Xpert MTB/RIF技术对南非班德地区40例(20例已确诊肺结核、20例为健康对照)儿童粪便进行MTB检测，结果发现取0.6 g和1.2 g粪便标本进行检测的灵敏度分别为85%和84%，特异度分别为100%和94%。以上研究说明Xpert MTB/RIF的检测结果会受到标本类型及标本量的影响，同时也说明该方法对儿童结核病的诊断也较为理想，另有研究报道该方法在排除疑似结核病患者方面有极大的诊断价值[33]。由于其能在快速准确地诊断结核病的同时检测MTB的利福平耐药性，WHO将Xpert MTB/RIF技术替代传统MTB检测技术作为诊断儿童肺结核、结核病/HIV双重感染患者的首选检测方法[34]。

2.3环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP) LAMP是以核酸扩增为基础的实验技术，该技术克服了聚合酶链反应技术需要热循环设备价格高以及对操作人员技术要求高等缺点，同时该技术采用4个MTB特异性引物以识别目标DNA上的6个不同的特异性区域以缩短反应时间并提高反应的特异度及灵敏度[13，35]。Bojang等[36]分别采用LAMP、细菌培养和Xpert MTB/RIF 3种方法对来自冈比亚441例患者的痰标本进行MTB检测同时对检测结果进行比较，结果以细菌培养为参考方法LAMP诊断结核病的总灵敏度为99%，特异度为94%，同时该研究得出LAMP和GeneXpert MTB/RIF有相似的高灵敏度及特异度。Yan等[37]对LAMP、同步扩增实验和Xpert MTB/RIF在以往实验室培养为参考方法诊断肺结核方面的研究中进行了荟萃分析，发现LAMP诊断的灵敏度和特异度为93%和94%，同步扩增实验诊断的灵敏度和特异度为96%和88%，Xpert MTB/RIF诊断灵敏度和特异度为89%和98%。由以上研究可知LAMP实验过程中不需要热循环仪器进行DNA扩增，具有快速、特异、灵敏和稳定等优点。LAMP也存在不足，由于该检测法是针对MTB的DNA为靶序列设计引物同时进行扩增，对死菌也表现为阳性结果，因此该方法不能对临床抗结核治疗效果进行监测，且实验过程中DNA双链结构稳定不易降解[38-39]。

2.4逆转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription-LAMP,RT-LAMP) RT-LAMP的扩增体系含逆转录酶、RNA酶抑制剂和RNA模板，这是与LAMP技术的几个不同之处[40]。由于16S rRNA为单链结构且仅大量存在于代谢增殖的活MTB中，因此合并反转录功能RT-LAMP技术能在LAMP技术的基础上进一步提高检测灵敏度，同时还可以判定活菌[41-43]。吴丹丹等[40]为了比较RT-LAMP和LAMP检测结核病的灵敏度和特异度，对122例患者(100例确诊肺结核患者、22例非结核菌感染患者)的痰标本分别采用RT-LAMP、LAMP、罗氏固体培养法进行MTB检测，以罗氏固体培养法进行对比，结果显示RT-LAMP在灵敏度和活菌检测方面存在LAMP不可超越的优势。由于RT-LAMP有技术操作简便同时可对临床抗结核治疗效果进行评估等优点，更适用于基层医疗单位使用。

2.5全基因组测序 随着测序技术的成熟、测序成本的降低，全基因组测序已在MTB的研究中发挥了巨大作用[44-45]，该技术是采用高通量测序仪对微生物的基因组核酸测序，以获取该细菌全部基因组DNA序列的方法。由于MTB自发突变率低，可以采用全基因组测序来分析菌株间单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)差异，然后通过SNP对MTB进行菌种鉴定、判断其传播方向、分辨复发与再感染或混合感染[46-48]。说明该方法在MTB流行病学研究方面有不可取代的地位。现有的耐药分子检测手段基本完成了利福平和异烟肼等一线抗结核药物的耐药诊断，而且其灵敏度和特异度可达90%以上[49]，但是目前已知的耐药突变位点不能解释所有表型耐药，若使用全基因组测序技术对MTB的相关基因耐药突变进行检测，则耐药检测就不再仅局限于几种一线抗结核药物，且该方法可以检测出更多的MTB药敏信息[50]。科学家们通过全基因组关联性分析探讨SNP与MTB表型之间的关系，Walker等[51]共收集3 000多株临床分离株进行全基因组测序及全基因组关联性分析，最终没有发现新的可靠耐药突变位点，考虑可能与临床菌株的遗传背景差异大、耐药机制复杂等有关。全基因组测序的优点为可以更准确、全面地诊断出MTB的菌种、基因突变位点及其耐药信息等，缺点为依赖细菌培养技术、分析流程繁琐、数据量大、现有研究结果异质性大等[52]。Brown 等[53]曾尝试脱离MTB细菌培养过程，将痰标本直接进行全基因组测序，并取得成功。尽管关于全基因组测序当前还有很多问题尚未解决，但其凭借极高的正确度、检测速度快等优势在发达国家已列入结核病常规诊断流程，在我国则多用于科学研究。

2.6基因芯片技术 在20世纪90年代初期，随着生物化学、遗传学等多学科交融发展以及多物种基因组测序的完成，DNA微阵列应运而生，即基因芯片技术。基因芯片是将根据MTB全基因组中保守的功能基因序列和SNP位点而设计的探针固定在一定的载体上，再加入荧光标记的待测样本核酸，通过分析荧光杂交信号来进行菌株鉴定，细菌基因分型，耐药性分析等；当前临床常用的有基因检测芯片，菌种分型芯片和耐药检测芯片等。王丹吉等[54]分别采用基因芯片技术，罗氏培养技术和传统药敏试验对1 297例肺结核患者的痰标本进行MTB异烟肼、利福平等耐药性的检测，以传统药敏方法为金标准，基因芯片检测异烟肼的特异度和灵敏度分别为97.42%、81.91%，检测利福平的特异度和灵敏度分别为98.18%、84.48%，结果说明基因芯片技术对于MTB耐药性的检测具有较高的灵敏度与特异度，非常适用于耐多药结核病的早期诊断。但其检出限达不到300 CFU/mL，说明敏感性不如GeneXpert MTB/RIF技术。许榕青等[55]研究结果提示以BACTEC MGIT960药敏结果为参考，基因芯片技术对异烟肼耐药性检测表现出较低的敏感性，且对于利福平耐药检测基因芯片法与基因测序结果也不完全一致，说明基因芯片检测的MTB基因位点范围略窄。针对基因芯片检测技术灵敏度不高这一问题，科研工作者应考虑进一步扩大基因芯片检测MTB基因位点范围。总之，基因芯片技术可以快速直接对痰标本MTB进行耐药性检测，检测结果具备较好的特异度与灵敏度，可以为临床结核病的诊治提供快速准确的实验室检测数据。

3 小 结

目前我国结核病实验室检测技术已取得长足进步，不少新的实验室检测技术已在各级医疗机构进行推广普及，新技术的应用也提高了结核病的诊断率。但当前用于结核病实验室检测的技术各有其优缺点，评价一种新技术的普适性需要大样本、大范围、多地区和多中心的临床实践来验证。为更好地解决以上问题，应该从宏观角度整合医疗卫生资源，加强相关人员学习及应用结核病实验室检测新方法、新技术的认知理念，逐步形成对新技术的验证、推广机制，提高我国整体结核病防治工作服务水平，以期在临床实践中不断对新技术进行改进和创新。相信通过各级结核病实验室对新技术的合理运用，我国临床结核病实验室诊断水平将会出现质的突破，从而更好地为临床结核病精准防治提供强力支持。