食管鳞状细胞癌PD-1/PD-L1表达及预后价值研究

陈俊升，焦 言，韩大力，杨文锋

(1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，济南 250022； 2.山东大学附属山东省肿瘤医院a.胸外科，b.放疗科，济南 250117； 3.曹县人民医院介入科，山东 菏泽 274400)

食管癌是全球第八大癌症，也是癌症相关死亡的第六大主要原因[1]，其发病率逐年上升，已严重威胁着人类的健康。根据组织学分类，食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌是食管癌的两种主要病理类型，其中前者占我国食管癌病例的90%[2]。程序性细胞死亡受体1(programmed cell death-1,PD-1)和程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是一对抑制性的协同刺激分子，其表达是T淋巴细胞介导的免疫反应的关键调节因素[3]。PD-1与PD-L1结合后能传递抑制信号，营造免疫抑制性肿瘤微环境，帮助肿瘤逃避免疫杀伤，促进肿瘤的进展[4]。研究证实[5-7]，PD-1/PD-L1在肿瘤发生、发展过程中起重要作用，并且影响患者的预后。PD-1/PD-L1作为肿瘤免疫治疗靶点成为研究的热点，但目前关于PD-1/PD-L1在食管癌中的报道相对较少。本研究主要探讨PD-1和PD-L1在ESCC中的表达情况，并研究其与各临床病理因素之间的关系和预后价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2017年12月在山东省肿瘤医院接受手术治疗的食管癌患者术后标本67例，经术后病理证实均为ESCC，所有患者术前均未接受过针对肿瘤的任何新辅助治疗或生物治疗，无全身免疫系统疾病，未患其他肿瘤。临床评估病情，所有患者术后至复发或末次随访期间均接受了数周期的化疗，未行其他抗肿瘤治疗。分期按照美国癌症联合委员会第8版食管癌分期标准[8]。入组患者临床病理资料通过本院病案管理系统查阅获得，其中男46例，女21例，年龄50～77岁，平均(62±7)岁，<60岁者24例，≥60岁者43例。分化程度：高分化20例，中分化21例，低分化26例。肿瘤部位：胸上段8例，胸中段38例，胸下段21例。其中33例出现淋巴结转移。35例

1.2免疫组织化学法检测PD-1/PD-L1的表达 将标本切制成4 μm左右厚切片，经二甲苯脱蜡和不同浓度梯度的无水乙醇脱蜡和水化后，用3% H2O2溶液避光室温孵育10～15 min，然后在0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中微波加热进行抗原修复15 min左右。加入兔抗人PD-1单克隆抗体(英国Abcam公司)和兔抗人PD-L1多克隆抗体(英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜。加入二抗(MaxVisionTM)，室温孵育20 min，然后磷酸盐缓冲液冲洗3次。最后加显色剂显色，苏木精复染，用dH2O洗涤数次后封片，光镜下观察拍照。

1.3表达结果判定 不同研究的判定标准并不统一。本研究随机选择5个高倍视野，计算阳性染色细胞所占的比例，取平均值作为每个标本的最终结果。参考相关文献[9-10]，分别将具有≥5%和≥10%肿瘤细胞染色的标本定义为表达阳性。样本表达情况由两名病理医师独立读片和评估，出现意见不一时，则重新拍照计数并进行讨论，直至达成共识。

1.4观察指标 显微镜下观察到染色呈黄(褐)色视为阳性。评估病情有无进展主要通过影像学检查(增强CT、钡餐造影)，出现局部复发(食管壁增厚或浸润附近组织器官)、新的淋巴结或远处转移均视为进展。

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，用Kaplan-Meier和Log-rank法进行生存分析，Cox回归模型用于单因素和多因素生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PD-1/PD-L1表达情况 以5%和10%阳性染色作为PD-1/PD-L1阳性表达临界值，PD-1阳性表达率分别为67.2%(45/67)和61.2%(41/67)，PD-L1阳性表达率分别为31.3%(21/67)和25.4%(17/67)，见图1。

2.2PD-1/PD-L1表达与临床病理因素的关系 不同性别、年龄、分化程度、肿瘤长径、吸烟、饮酒、淋巴结转移及肿瘤部位PD-1和PD-L1的阳性表达率比较差异均无统计学意义(P>0.05)；PD-L1的表达与肿瘤T分期有关，

2.3PD-1/PD-L1表达与肿瘤标志物的关系 无论以5%还是10%作为表达临界值，PD-1和PD-L1在不同水平的CEA、NSE和Cyfra21-1的患者癌组织中的表达阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

1a：PD-1阴性；1b：PD-1阳性；1c：PD-L1阴性；1d：PD-L1阳性

ESCC：食管鳞状细胞癌；PD-1：程序性细胞死亡受体1；PD-L1：程序性细胞死亡配体1

表2 PD-1/PD-L1表达与肿瘤标志物的关系 [例(%)]

ESCC：食管鳞状细胞癌；PD-1：程序性细胞死亡受体1；PD-L1：程序性细胞死亡配体1；CEA：癌胚抗原；NSE：神经元特异性烯醇化酶；Cyfra21-1：细胞角蛋白19片段抗原

2.4生存和预后影响因素分析 随访截止日期2018年11月5日，59例患者出现疾病进展，总体中位无进展生存期(progression free survival,PFS)为12.29个月。单因素生存分析结果显示，PD-1表达和肿瘤部位与PFS有关。5%作为临界值时，PD-1表达阳性和阴性患者中位PFS分别为10.0个月和13.2个月，10%作为临界值时对应的中位PFS分别为9.6个月和13.1个月，PD-1阳性患者的PFS比阴性患者短(5%作为临界值：χ2=10.270，P=0.002，HR=2.606；10%作为临界值：χ2=8.176，P=0.005，HR=2.252)(表3、图2a和2b)。胸上、中段肿瘤患者中位PFS比胸下段患者短(10.1个月比14.0个月)，差异有统计学意义(χ2=8.136，P=0.004)(图2c)。多因素生存分析结果显示，肿瘤部位和PD-1表达是患者PFS的预后因素(P<0.05)。见表4。

3 讨 论

表3 单因素Cox回归模型分析与PFS相关的危险因素

PFS：无进展生存期；PD-1：程序性细胞死亡受体1；PD-L1：程序性细胞死亡配体1

表4 多因素Cox回归模型分析与PFS相关的危险因素

PFS：无进展生存期；PD-1：程序性细胞死亡受体1；PD-L1：程序性细胞死亡配体1

2a：5%为临界值PD-1表达与PFS；2b：10%为临界值 PD-1表达与PFS；2c：肿瘤部位与PFS

图2 ESCC患者的生存分析

本研究结果显示，PD-1和PD-L1在ESCC患者肿瘤组织中存在过表达。有研究比较了癌组织和正常组织，发现前者PD-1和PD-L1的阳性表达率远高于后者，也说明PD-1/PD-L1表达可能与肿瘤的发生有关[17-18]。本研究结果显示不同部位的肿瘤PD-1和PD-L1表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，Chen等[10]发现食管不同位置癌的PD-L1阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。多项研究显示PD-L1的表达与肿瘤浸润深度有关[17,19]，本研究也得出类似结论，提示PD-L1可能会促进肿瘤的进展。以往研究大多数是选择一个固定的阳性表达临界值，本研究分别以5%和10%作为表达临界值，结果提示临界值的选择会影响最终的统计结果，这也是不同研究得出分歧结论的原因之一。有研究提示表达临界值的选择会影响对PD-1/PD-L1预后价值的判断[19]。

通过检索相关数据库，尚未发现关于PD-1/PD-L1表达与ESCC患者血中肿瘤标志物关系的文献报道。因此，本研究纳入了本院针对食管癌患者常检测的3种肿瘤标志物：CEA、NSE和Cyfra21-1，并分析其与PD-1/PD-L1表达的关系。结果显示，CEA、NSE和Cyfra21-1阳性率分别为45%、20%和32.5%。肿瘤标志物是一大类化学物质，某些肿瘤标志物水平升高会提示特定的肿瘤存在，如CEA与结直肠癌,甲胎蛋白与肝癌,NSE与神经内分泌肿瘤。目前ESCC尚未发现比较特异性的肿瘤标志物。传统的肿瘤标志物，如CEA、Cyfra21-1可辅助用于诊断和评估ESCC进展，但这些肿瘤标志物在诊断ESCC时灵敏度较低。有研究报道CEA对ESCC诊断的个体灵敏度约为28%[20]，Yamamoto等[21]研究结果示Cyfra21-1的灵敏度达47.9%，特异度为100%，所以Cyfra21-1是ESCC的重要标志物。有研究发现Cyfra21-1和CEA可能有助于预测ESCC患者对放化疗的敏感性[22]。这些结果表明，传统ESCC肿瘤标志物的诊断敏感性虽然不高，但可起到辅助诊断和评估疗效的作用。本研究纳入的3种肿瘤标志物在ESCC中阳性率均不高，说明对诊断的特异度不大，对其进行检测可起到辅助诊断作用，金标准仍依然靠病理学检查。PD-1/PD-L1可促进肿瘤的发生、发展，肿瘤标志物水平在一定程度上可对疾病状态进行评估，但本研究发现PD-1/PD-L1的表达与所选3种肿瘤标志物水平无关，提示两者之间并不存在协同联系，但此结论仍需要大量的数据来进一步证实。

目前相关研究结果表明，PD-1/PD-L1表达与预后的关系尚存有争议。有研究认为阳性表达提示预后差[9,23]，也有研究持不同观点[24-26]。本研究结果显示，PD-1阳性表达患者的PFS较阴性表达患者差，多因素分析得出PD-1表达是PFS的预后因素，但PD-L1与PFS无相关性。另外，肿瘤部位可能影响患者PFS，胸下段食管癌患者中位PFS长于胸中、上段患者，但其统计学意义有待进一步验证。本研究入组样本量偏少，这可能在一定程度上对结果造成偏倚。另外，由于大部分患者术后时间偏短，目前尚未分析PD-1/PD-L1的表达与总生存率的关系。未来需要大量的研究来获取更多数据，进一步确定PD-1/PD-L1的预后价值。

食管癌的标准疗法包括手术切除、化学治疗和放射治疗，据报道，多疗法相结合的多学科综合治疗是最有效的[27-28]。有研究提示在常规手段治疗时配合抗PD-1/PD-L1辅助治疗可能会为患者带来更大的生存获益[29]。目前已存在多种抗PD-1/PD-L1药物，有些已被批准用于临床，而有些仍处于试验阶段。未来的研究应着重测试这些药物的疗效以及用药安全性，并评估它与其他癌症疗法结合后的综合受益情况。