高通量测序在妇科恶性肿瘤早期筛查中的应用进展

黄 柯，孟元光

(解放军总医院妇产科，北京 100039)

统计学研究显示当前全球范围内新增癌症病例约1800万，死亡人数达960万，其中女性癌症中宫颈癌的发病率占13.1%，死亡率达6.9%[1]。我国新发肿瘤病例380.4万例，死亡病例高达229.6万例，这意味着我国癌症新发例数占全球总数的20%以上，同时在女性发病率前10位的癌症中，宫颈癌和子宫癌的发病率及死亡率均排名靠前[2]。随着中国步入老龄化社会，老年女性子宫颈癌和宫内膜癌的发病率有所升高[3]。宫颈癌是妇科恶性肿瘤中发病率最高的生殖系统肿瘤，虽然目前液基薄层细胞检测技术的成熟和人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)疫苗的应用，子宫颈癌的发病率有所降低，但由于HPV疫苗价格昂贵，尚不能在我国普及[4]。由于宫颈癌筛查并不普及，我国宫颈癌的发病率和死亡率仍高于发达国家[5]。近年来子宫内膜癌的发病率也呈上升趋势。一方面是由于宫颈癌早期诊断率的提高以及子宫颈上皮内瘤样病变阶段手术切除率的增加，子宫内膜癌发病率的升高；另一方面，影响子宫内膜癌发生的高危因素持续存在，如2型糖尿病、不孕症、多囊卵巢综合征以及终生拒绝妊娠女性的增加都导致子宫内膜癌的发病率逐年升高[6]。

卵巢癌的发病率虽然不高，但其具有易复发、易耐药以及早期难发现的特点而导致卵巢癌的预后非常差，是致死率较高的女性生殖系统肿瘤[7]。以上海为例，卵巢癌的发病率和死亡率近40年来未有明显改观[8]。因此，寻找能够早期筛查宫颈癌和子宫内膜癌的手段，以期早诊断、早治疗非常重要。现就高通量测序技术在上述肿瘤早期筛查中的应用进行综述。

1 高通量测序的运用

高通量测序又称下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术，其能同时对几十万到几百万条的DNA分子并行序列测序。相对于第1代焦磷酸法测序技术，NGS在速度方面有明显提高，并可同时获取丰富的基因遗传学信息。基于NGS技术相关的肿瘤学研究日益增多，有潜在应用价值的方法如下。

1.1靶向测序 靶向测序是针对目标基因区域设计芯片和探针，区域DNA富集后进行深度测序分析，具有常规检测方法不可比拟的优势[9]。相较于全基因组和转录组测序，靶向区域测序的目标序列较少。靶向测序的优点是测序深度高、成本低、速度较快，可获得更为准确的测序结果。靶向测序常用于获取疾病相关致病基因和易感基因的信息，用于指导筛选临床高危人群和制定个性化治疗方案；缺点是无法进行探索性研究，不能识别未知突变基因[10]。

1.2外显子测序 外显子测序的靶向检测目标是编码外显子的基因序列，是一种将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子组包括约1%的基因组、约85%的致病突变，外显子组测序可检测出单核苷酸变异，小部分基因插入或缺失，以及罕见的新生突变，可有效检测恶性妇科肿瘤疾病的基因遗传率[11]。外显子测序相对于基因组重测序成本低，对研究已知基因的单核苷酸变异、基因插入或缺失等具有较大优势，但外显子测序无法研究基因组的结构变异如染色体断裂重组等。由于测序未涉及内含子序列，所以并不适用于研究肿瘤的调控机制[12]。由于目前对肿瘤发生学的理论研究主要集中在基因突变以及调控异常方面，所以除个别遗传性肿瘤外，全外显子组测序尚可满足临床需求。但随着对肿瘤发生机制研究的深入，癌症早期如与调控序列有关的话，外显子测序就不能满足临床需求。

1.3甲基化测序 甲基化测序能直接对任何物种的高甲基化片段进行测序而无须知道基因组的序列信息。DNA基因甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持细胞功能、胚胎发育以及人类肿瘤发生中发挥着重要作用[13]。对所有富集的甲基化DNA片段进行高通量测序能够明确全基因组的甲基化状态，为表观遗传学中的调控分析提供了更有利的切入点。有学者研究了卵巢癌组织中钙黏蛋白基因CDH10、CDH13以及CDH18的甲基化情况，与健康对照组相比，卵巢癌标本中CDH13基因的甲基化显著增高，CDH10基因散发甲基化，而CDH18基因甲基化丧失[14]。上述研究表明，钙黏蛋白基因的甲基化可能是卵巢癌进展的机制之一；其次，由于CDH13基因在卵巢癌早期的甲基化频率较高，对胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点的甲基化分析可能是下一步研究卵巢癌早期筛查生物标志物的主要方向之一[15]。

1.4单细胞全基因组测序 单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的技术。它是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得其完整基因组后探寻细胞群体差异和细胞进化关系[16]。已有研究通过激光显微切割分离卵巢癌石蜡切片的单细胞，然后进行单细胞全基因组测序，分析不同卵巢癌细胞的基因状态[17]。结果发现，不同单细胞中相同基因座处均存在甲基化和未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤，即同一细胞亚群中显示异质DNA甲基化状态[17]，不过由于成本原因，目前该技术主要用于科研领域。

2 NGS筛查妇科恶性肿瘤

目前在妇科恶性肿瘤领域，早期筛查时使用NGS相关技术的报道较少，一方面由于NGS筛查成本较传统方法高；另一方面由于NGS能检测到的突变较多，但又缺乏大规模人群的正常对照数据进行解读，导致NGS的临床应用受到限制。NGS应用于妇科恶性肿瘤的优势也较多，是当前临床研究的热点。

2.1NGS检测在宫颈癌筛查中的应用 宫颈癌传统早期筛查方法已经很成熟，可直接取材、成本较低，且样本质量较好，质控体系也较完善。宫颈癌的早期筛查主要以高危型HPV检测联合液基薄层细胞检测技术为主[18]。但目前还没有更好的方法对高危型HPV感染者进行分层，毕竟终生高危型HPV阳性且不罹患宫颈癌的女性也并非少数。如何降低高危型HPV阳性女性的心理负担和筛查频率，如何进行进一步分层是临床急需解决的问题[19]。目前虽然有学者对包括甲基化检测、HPV整合位点分析等方法进行了有益探索，但得到的数据相对于传统方法仍然较少[20]。有学者利用NGS检测在宫颈癌细胞系中发现12个基因启动子(ARHGAP6、HAND2、LHX9、HEY2、NKX2-2、PCDH10、PITX2、PROX1、TBX3、IKBKG、RAB6C和DAPK1)存在甲基化，这为宫颈癌的早期检测和临床管理提供了基因特异性甲基化方面的有效生物标志物[21]。

2.2NGS检测在子宫内膜癌筛查中的应用 子宫内膜癌的早期筛查目前尚未有规范内容，筛查多依赖于妇科超声或磁共振成像结合子宫内膜活检技术，更早期的筛查多是在行子宫颈液基薄层细胞学检测过程中捕获到从宫腔脱落的异形细胞间接发现，这属于机会性因素，不能作为标准筛查方法。

因子宫内膜高危患者多合并有肥胖，导致子宫内膜活检难度增大，并有漏检风险，常规活检无法做到对子宫内膜癌的早期准确筛查[22]。目前利用子宫颈部细胞DNA的异常变化来推测子宫内膜癌的早期癌前病变是一个新的研究方向，已有学者利用诊断性刮宫或子宫腔灌洗细胞进行循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)测序分析，以预测或辅助子宫内膜癌的早期诊断[23]。有研究分析了107例接受宫腔镜检查和刮宫术患者的宫灌洗液样本,并从灌洗液中分离出细胞中和游离的DNA，然后进行超深度高通量测序，结果发现7例患者的宫腔镜检查经典刮除组织中有子宫内膜癌的前驱动突变，大约有50%的女性未在癌症确诊的灌洗液中鉴定出相对较多的等位基因驱动突变[24-25]。因此，NGS有可能用于子宫内膜癌的早期筛查。

Maritschnegg等[23]发现，Ⅱ型卵巢癌和子宫内膜癌通过宫腔灌洗收集脱落细胞进行基因突变检测，可实现卵巢癌和子宫内膜癌的早期检测，甚至是临床上尚无症状的卵巢癌。Xia等[26]利用NGS技术结合18种基因突变检测方法以及非整倍性检测方法对子宫内膜癌患者和卵巢癌患者进行检测发现，对382例子宫内膜癌患者的宫颈脱落细胞进行基因检测发现，81%的患者基因突变为阳性，其中78%为早期疾病患者；245例卵巢癌患者中相关基因突变率为33%，其中34%为早期癌症患者；而在714例无癌症的女性中只有1.4%宫颈脱落细胞基因突变为阳性(特异度为99%)；随后进行子宫内膜取样NGS检测发现，有93%(114/123)的子宫内膜癌患者和45%(23/51)的卵巢癌患者18种基因测序突变为阳性，而125例未患癌者均为阴性；在可获得血浆的83例卵巢癌患者中，43%的患者ctDNA阳性;检测血浆和脱落细胞时，卵巢癌的灵敏度为63%。上述结果表明，NGS检测基因突变可作为早期筛查妇科恶性肿瘤的辅助手段。

2.3NGS检测在卵巢癌筛查中的应用 卵巢癌的早期诊断仍是目前临床无法根本解决的难题。以前对微RNA和长链非编码RNA研究比较多，但现在认为微RNA主要与调控有关，涉及相关通路的激活或抑制，因而目前主要用于监控和治疗癌症患者，而非早期筛查[27]。癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)检测联合妇科超声检查组成了现在最常用的妇科恶性肿瘤筛查方法，包括对CA125动态变化的分析[28]。这些检测方法虽然成熟，但阳性符合率和假阳性率均不佳，且部分卵巢癌患者早期并无CA125的升高，首发症状即为腹胀、腹水。如何早期发现卵巢癌或在癌前病变阶段发现卵巢癌，一直是临床医师和科研人员探索的方向。基于卵巢癌发生学观点，有研究认为卵巢癌是输卵管来源的恶性肿瘤，在肿瘤组织中已经鉴定出输卵管上皮是高级别浆液性卵巢癌的祖细胞群之一[29]。同时卵巢子宫内膜样癌和透明细胞癌均出现了KRAS基因、PIK3CA基因、CTNNB1基因、ARID1A基因以及PTEN基因突变，且TTC28-L1转导以及经典的驱动突变在肿瘤中几乎普遍存在，这表明L1激活可能发生在子宫内膜异位症相关的卵巢癌的早期，TTC28-L1转导可用于确定克隆关系和跟踪卵巢癌进展[30]。最近开展的一项研究是利用ctDNA检测肿瘤细胞，其采用的分子检测技术为PapGene检测，以期早期识别小体积的卵巢高级别浆液性癌或浆液性输卵管上皮内癌的癌前病变[31]。NGS在卵巢癌中应用的最终目标是评估PapGene和ctDNA测试检测高级别浆液性卵巢癌的作用特征，研究PapGene和ctDNA检测在高卵巢癌风险女性中预测早期病变和微小卵巢癌病变的价值；确定PapGene试验作为前瞻性队列研究中高级别浆液性卵巢癌筛查工具的临床效用[32]。

3 小 结

从宫颈管细胞涂片、子宫腔脱落细胞或灌洗液等得到的样本中提取基因进行NGS，可有效筛查出妇科恶性肿瘤相关基因的突变，从而为妇科恶性肿瘤的早期筛查提供新思路。高通量基因测序筛查妇科恶性肿瘤的敏感性和准确度优势是传统检查技术无法超越的。基于ctDNA、无细胞DNA等新技术用于NGS获取样本信息将更有助于指导妇科恶性肿瘤的临床靶向治疗方案的制定和调整。目前为实现癌症的无创早期筛查，Johns Hopkins Kimmel癌症中心的科学家开发了一种高通量测序检测血液中微量肿瘤特异性DNA的技术，其已准确筛选识别了138例相对早期的结直肠癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者[33]，证实NGS用于妇科恶性肿瘤是具有可行性的。也有学者将NGS与蛋白质组学结合起来，但由于蛋白质组学技术的稳定性目前还不能保证，临床应用前景相对较远[34]。目前妇科恶性肿瘤NGS早期筛查技术的发展方向仍是ctDNA和甲基化检测，随着ctDNA技术的成熟，NGS将更多地应用于卵巢浆液性癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、宫颈鳞癌和腺癌的早期筛查。总之，应用NGS技术进行早期妇科恶性肿瘤的筛查虽然还不完善，但其以无创活检为目标的精准筛查、精准治疗将是未来妇科恶性肿瘤诊治领域的大方向。