正交试验法优选山黄祛痛喷雾剂醇提工艺

林新艳，王 宓，徐 超，殷书梅

（江苏康缘阳光药业有限公司，江苏 南京 210046）

山黄祛痛喷雾剂是由南京中医药大学汪悦教授有效验方筛选而成的中药注册六类新药，由丽江山慈菇、凤仙透骨草等4味中药组方，具有清热解毒、消肿止痛之功效，用于急性痛风性关节炎湿热蕴毒证。方中君药丽江山慈菇主要化学成分为秋水仙碱、角秋水仙碱、β-光秋水仙碱及N-甲酸-N-去乙酰秋水仙碱等多种生物碱［1］，其中有效成分秋水仙碱为小分子化合物，易溶于冷水、乙醇、氯仿等，在乙醚中极微溶解，在热水中难溶，对急性痛风性关节炎有选择性抑制作用。凤仙透骨草主要化学成分为东莨菪素、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、蹄纹天竺素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷及飞燕草素-3-葡萄糖苷等，主要为黄酮苷类成分，不溶或难溶于水，在乙醇中溶解性能较好［2-3］。本研究中通过L9（34）正交试验法，选择秋水仙碱、槲皮素含量和出膏率为指标，考察山黄祛痛喷雾剂醇提工艺条件，提高了有效成分转移率，为产品的制备和进一步研究提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪及DAD二极管阵列检测器（安捷伦科技有限公司）；Mettler AB135-S型电子天平（十万分之一，梅特勒-托利多公司）；SY2000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SK8200HP型超声波清洗机（上海科岛自动化系统有限公司）。

1.2 试药

丽江山慈菇Iphigenia indicaKunth和凤仙透骨草Impatiens balsaminaL.均购自亳州市谯港药业有限公司，经江苏省食品药品检验研究院胡浩斌主任药师鉴定为正品，符合法定要求［4-5］；秋水仙碱对照品（美国sigma公司，批号为2005985，纯度为98.0%）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111514-200403，纯度为98.0%）；甲醇（色谱纯，美国Merk公司，批号为20100825）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

以乙醇作为提取溶剂，采用L9（34）正交试验法对乙醇浓度（因素 A）、乙醇用量（因素 B）、回流时间（因素 C）、回流次数（因素D）进行2味药材的回流提取工艺优选，选取有效成分秋水仙碱、槲皮素含量和出膏率为指标进行测定。因素水平见表1。

2.2 正交试验样品制备

称取丽江山慈菇9 g、凤仙透骨草6 g，共9份，分别按正交试验表所列条件回流提取，合并提取液，回收乙醇，适量浓缩，分别定容至100 mL，备用。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

2.3 秋水仙碱含量测定

2.3.1 丽江山慈菇药材处理

取丽江山慈菇粉末0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，以70%甲醇25 mL水浴回流提取2次，每次2.0 h，放冷，滤过，滤液减压回收至干，以甲醇定容至25 mL容量瓶中，以 0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.2 溶液制备

取秋水仙碱对照品适量，精密称定，用70%甲醇配制成质量浓度为 0.018 9 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。取醇提正交试验样品溶液，精密移取1 mL置25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀释至刻度，离心，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3.3 色谱条件

色谱柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水（45 ∶55）；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm；进样量：10 μL。

2.4 槲皮素含量测定

2.4.1 凤仙透骨草药材处理

图1 高效液相色谱图

取凤仙透骨草粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，精密加入25%盐酸7 mL，置85℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至50 mL容量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.2 溶液制备

精密称取槲皮素对照品适量，用甲醇配制成质量浓度为 0.006 22 g／L 的溶液，以 0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。

取醇提正交试验样品溶液，精密移取10 mL置蒸发皿中，蒸至近干，加入甲醇15 mL、25%盐酸7 mL溶解残渣并转移至锥形瓶中，水浴回流30 min，滤过，转移至25 mL容量瓶中，以70%甲醇稀释至刻度，离心，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4.3 色谱条件

色谱柱：Phenomenex luna C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（40 ∶60）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：360 nm；进样量：10 μL。

2.5 指标成分含量测定结果

经高效液相色谱法［6-7］测得丽江山慈菇药材中秋水仙碱含量为4.09 mg／g，色谱图见图1。根据槲皮素理化特性槲皮素含量测定方法［8］，测得凤仙透骨草药材中槲皮素含量为0.189 mg／g，色谱图见图2。

2.6 正交试验结果与分析

9份样品中测得的丽江山慈姑中秋水仙碱含量、凤仙透骨草中槲皮素含量及出膏率结果见表2。按正交试验条件采用综合评分法，对影响提取工艺的主要因素设定权重系数，秋水仙碱转移率（Ya）为0.5，槲皮素转移率（Yb）为 0.3，出膏率（Yc）为 0.2，进行加权评分，公式为Y＝0.5Ya+0.3Yb+0.2Yc。方差分析结果见表 3。

图2 高效液相色谱图

表2 回流提取工艺正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

由方差分析结果可知，各因素对提取影响大小顺序为D＞A＞C＞B，最优工艺水平为A2B3C2D2，即10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h。回流提取次数为最显著影响因素，乙醇用量为最小影响因素，而8倍量溶剂（K＝213.29）与 10倍量溶剂（K＝213.53）在提取效率上无显著差异。从产业化节约能耗方面考虑，宜选择8倍量溶剂进行回流提取。

2.7 验证试验

取3份同批次丽江山慈菇与凤仙透骨草药材，按以上正交试验优选的提取工艺进行验证，每份样品平行测定2次。结果3份样品中秋水仙碱每1 g生药平均含量分别为 3.61，3.60，3.64 mg；槲皮素每 1 g 生药平均含量分别为 0.163，0.161，0.165 mg。验证试验结果显示，优选工艺条件在有效成分提取率和重复性上具有较好优势。

3 讨论

山黄祛痛喷雾剂处方中君药丽江山慈菇的主要成分为秋水仙碱，是痛风性关节炎有效的首选抗炎剂，对急性痛风性关节炎有选择性抑制作用［9］，其作用机制在于秋水仙碱能和微管蛋白结合，妨碍有丝分裂中纺锤体的功能，并引起粒细胞和其他可移动细胞中原纤维微管解聚和消失。这是秋水仙碱有效作用的基础，即抑制粒细胞移向发炎区，减少粒细胞代谢和吞噬活动［10］，减少了发生于吞噬作用的乳酸和引起炎症的酶的前体释放，打破炎性反应的循环。其次，凤仙透骨草中有效成分槲皮素的药理活性甚广，具有抗炎、抗过敏、正性肌力作用、降低毛细血管通透性、降低血清胆固醇等作用［11-13］，同时还有良好的镇痛作用，显著的特点是小剂量局部用药速效、高效。

中药是一个物质群，其药效作用更是物质群的综合作用。控制中药的内在质量，即需要对中药内在化学物质进行控制。目前，对山黄祛痛喷雾剂复杂的物质群及其与功效之间的相互关系了解有限，因此，只能选取有限的具有生物活性的多个指标综合考察山黄祛痛喷雾剂醇提工艺。丽江山慈菇和凤仙透骨草在法定药材标准中尚无含量检测项，根据指标成分秋水仙碱和槲皮素的理化特性，确定了乙醇浓度、乙醇用量、回流时间、回流次数4个影响因素，并采用L9（34）正交试验进行考察，最终得出回流提取最佳工艺为丽江山慈菇和凤仙透骨草采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5h。在此条件下，秋水仙碱和槲皮素成分提取率和出膏率最高，且提取方法稳定、可靠，可为山黄祛痛喷雾剂后续产业化发展提供参考。