基于指纹图谱及化学识别模式的乌梅炮制品质量评价*

孙 全，徐 冲，刘 霞，郭小红，李 杰，冷 静

（重庆市中医院药剂科，重庆 400021）

乌梅为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.Et Zucc的干燥近成熟果实，具有敛肺、涩肠、生津、安蛔之功效，药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为中品，常用于肺虚久咳，久泻久痢，虚热消渴，蛔厥呕吐、腹痛等［1］。《金匮玉函经》《备急千金要方》《外台秘要》《普济方》均提及乌梅炮制方法，有醋泡、醋蒸、醋煮等。2015年版《中国药典（一部）》收载的乌梅及其饮片包括乌梅［2-3］、乌梅肉［4］、乌梅炭［5-6］。目前关于乌梅及不同炮制品指纹图谱的比较研究少见报道。本研究中采用指纹图谱相似度评价与化学识别模式相结合的方式［7-14］综合分析乌梅不同炮制品的质量，为其质量控制和临床应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；XA205DU型天平（十万分之一，梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；AS10200AT型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试药

乌梅（四川新荷花中药饮片股份有限公司，批号为D1506073），经重庆市中医院药剂科副主任中药师陈玲鉴定为正品，符合2015年版《中国药典（一部）》乌梅项下的规定。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备

取乌梅药材100 g，加入米醋200 mL，浸泡12 h，干燥，得醋乌梅。取乌梅肉，预热炒药锅至100℃时投入乌梅肉100 g，并待锅温升至235℃时开始计时，控制此温度不变，共炒制8 min，迅速出锅，熄灭火星，摊凉即得乌梅炭［15］。取乌梅药材 100 g，加醋 45 mL，拌匀，分别隔水蒸2，3，4 h，干燥，得不同蒸制时间的醋蒸制乌梅样品。

2.2 提取溶剂考察

采用不同的提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）进行超声处理，将提取液进行液相分析，30%甲醇提取液的色谱峰较多，故选择30%甲醇作为乌梅各种炮制样品的提取溶剂。

2.3 测定波长选择

通过紫外全波长扫描，乌梅提取液在215，288，314 nm波长处有最大吸收，分别将215，288，314 nm作为检测波长对乌梅进行分析，乌梅提取液在215 nm波长处的基线较平稳，色谱峰较多，故选215 nm作为检测波长。

2.4 供试品溶液制备

取乌梅不同炮制品样品1 g，精密称定，加入50 mL 30%甲醇，称定质量，超声提取1 h，用30%甲醇补足减失的质量，提取液用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.5 色谱条件

色谱柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；检测波长：215 nm；流速：0.6 mL ／min；柱温：25 ℃；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（见表 1）。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.6 方法学考察

精密度试验：取同一供试品溶液，精密称定，连续进样6次。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.31%（n＝6），相对峰面积的RSD为 2.36% （n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品粉末共6份，每份约1 g，按2.1项下方法制备供试品溶液，分别进样。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.80%（n＝6），相对峰面积的RSD为3.67%（n＝6）。表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h时进样测定。结果各共有峰相对保留时间的RSD为 0.24% （n＝5），相对峰面积的RSD为 2.95%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 对照指纹图谱的建立

分别称取乌梅不同炮制品样品，按2.4项下方法制备供试品溶液。取各供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录65 min的色谱图，导出乌梅不同炮制品色谱图的AIA格式文件，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行分析。

2.8 高效液相色谱（HPLC）特征图谱相似度分析

用中位数法建立对照指纹图谱，并进行多点校正及色谱峰的匹配，共标定25个共有峰，各样品选定共有峰的峰面积总和均大于50%，相对保留时间的RSD均小于1%。根据相似度评价结果，乌梅、醋乌梅、醋蒸制乌梅与对照指纹图谱的相似度均较高；乌梅炭与对照指纹图谱的相似度均较低。结果见图1，表2和表3。

图1 乌梅不同炮制品高效液相色谱特征指纹图谱及共有模式

表2 乌梅及不同炮制品共有峰峰面积及相对峰面积

表3 乌梅及不同炮制品HPLC特征指纹图谱相似度评价结果

2.9 主成分分析

以乌梅不同炮制品的HPLC特征指纹图谱共有峰的峰面积为变量，采用SPSS 22.0统计软件对原始数据作标准化处理后进行主成分分析。以主成分的特征值及贡献率为依据选择主成分，结果见表4。前3个主成分特征值均大于1，累计贡献率为92.468%，包含了大部分的信息。其中，主成分1的特征向量载荷较高且符号为正的共有峰相对保留时间（tR）分别为 5.252，6.579，10.542，16.831，22.910，47.367 min；主成分 2 的特征向量载荷较高且符号为正的共有峰的tR分别为5.053，5.629，9.608，22.910，50.961 min；主成分 3 的特征向量载荷较高且符号为正的共有峰tR分别为12.508，54.176，54.875 min。详见图 2。

表4 主成分特征值及贡献率

图2 三维载荷图

以各样品在主成分1、主成分2、主成分3中的得分绘制 3D 得分图。由图 3 可知，样品 S1，S2，S4，S5，S6 距离较近，可分为一类。样品S3可分为一类，主成分分析结果与相似度分析结果基本一致，进一步验证了相似度分析的可靠性。

图3 主成分3D得分图

3 讨论

3.1 色谱条件优化

为得到峰形，分离度较好，色谱信息较丰富的HPLC指纹图谱，本试验中对乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-水、甲酸-磷酸溶液等不同流动相组成及流动相比例进行了梯度洗脱考察。并考察了不同测定波长215，288，314 nm对测定结果的影响。结果以 Phenomenex C18柱作为色谱柱，检测波长为215 nm，流速为0.6 mL ／min，柱温为 25 ℃ ，流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脱为能得到较好指纹图谱信息。

3.2 相似度评价与主成分分析

相似度评价结果显示，乌梅及醋炮制乌梅与对照指纹图谱之间的相似度较高，均在0.950以上，乌梅炭与对照指纹图谱的相似度较低。通过绘制主成分1、主成分2、主成分3的3D得分图，乌梅与醋乌梅在3D散点图中的空间距离较近，可划分为一类，而乌梅炭与乌梅及醋乌梅相距较远，分为一类。相似度的评价结果与主成分分析结果一致，表明炒炭过程造成乌梅化学成分的变化较大。

3.3 指纹图谱对乌梅及炮制品质量评价的意义

中药炮制后可达到增强疗效，降低毒副作用，改变或缓和药性，引药归经等作用。醋制可引药入肝经，并有引药入血及收敛等作用。由于乌梅醋制研究现状的薄弱，临床用药时往往与炭炒发生混用。乌梅不同炮制品指纹图谱结果显示，乌梅及醋乌梅指纹图谱信息既有共性又有差异，化学成分种类基本一致，但峰面积有所不同。乌梅炭与乌梅及醋乌梅化学成分及含量都有较大差异。本研究中通过指纹图谱与化学识别模式相结合的方式评价乌梅及不同炮制品的质量，可为其药理作用的差异进一步研究及临床用药提供一定的依据。