洋葱醇提物总多酚含量及其抗氧化活性研究*

李佩儒 ，周春阳，张 译 ，林 勇 ，李莎莎 ，刘 慧 ，杨春艳 △

（1.川北医学院药学院·川北医学院药物研究所，四川 南充 637100； 2.川北医学院预防医学系，四川 南充 637100）

洋葱Allium cepaL.，别名玉葱、葱头等，为百合科（Liliaceae）葱属Allium草本植物，洋葱种植和食用已有5 000多年历史。现代化学成分研究表明，其含有多酚、甾体皂苷、有机硫化物（organosulfur compounds，OSCs）、多糖等次级代谢产物［1-4］，具有降血糖、调血脂、抗血栓、抗动脉硬化、防治冠状动脉粥样硬化性心脏病和糖尿病等多方面的生理保健功能［5-9］。多酚类物质最重要的功能是抗氧化和清除自由基［10］。因此，本研究中采用福林酚法测定洋葱总多酚含量，采用单因素试验和正交试验优化最佳显色条件，并采用2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法评价洋葱醇提物的抗氧化活性。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1750型紫外分光光度计（日本岛津公司）；FA2004型电子天平（0.000 1 g，上海良平仪器仪表有限公司）；KQ-300DE型台式数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；HH-9型数显恒温水浴锅（金坛市国旺实验仪器厂）。

1.2 试药

洋葱（市售）；没食子酸（成都市科龙化工试剂厂，批号为20120227）；芦丁（成都曼斯特生物科技有限公司，批号为 MUST-16111111）；DPPH（美国 Sigma公司，批号为 034K1071）；ABTS（Aladdin 公司，批号为 201406）；水为自制超纯水；钨酸钠（上海中秦化学试剂有限公司，批号为20161227），钼酸钠（天津市化学试剂四厂，批号为20141119），硫酸锂（天津市巴斯夫化工有限公司，批号为20160409）等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总多酚含量测定

2.1.1 溶液制备

称取干燥的没食子酸10.00 mg，精密称定，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至100 mL，制成每1 mL含0.1 mg没食子酸的溶液，得对照品溶液，4℃冰箱保存备用。

取鲜洋葱（市售）于60℃恒温鼓风干燥箱中干燥，粉碎；取洋葱粉217.5 g，以70%乙醇（料液比为1∶10）溶解，超声波辅助提取法（UAE）提取3次（每次30 min），得洋葱醇提物163.5 g，4℃冰箱保存备用；取洋葱醇提物0.14 g，加水溶解并定容至100 mL，抽滤，得供试品溶液，4℃冰箱保存备用。

称取钨酸钠8g和钼酸钠2g置圆底烧瓶中，用56mL蒸馏水溶解，加入4 mL 85%磷酸溶液和8 mL浓盐酸，文火回流10 h，然后加入1.2 g硫酸锂及6 mL氢氧化钠，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入100 mL容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，得福林试剂，4℃冰箱保存备用。

2.1.2 检测波长选择

精密吸取供试品溶液与对照品溶液各0.4 mL，置5 mL容量瓶中，加入1 mL水，摇匀，加入福林试剂0.5 mL，摇匀，放置1 min；加入10%碳酸钠溶液1 mL，加水稀释至刻度，充分摇匀后置60℃恒温水浴锅中反应60 min，以相应的提取溶剂为空白溶剂，于550～850 nm波长范围内扫描，记录紫外光谱图。结果见图1。洋葱醇提物和没食子酸对照品溶液与福林试剂反应后均在760 nm波长处有稳定的最大吸收峰，故确定检测波长为760 nm。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：将2.1.1项下所配溶液稀释5倍，精密吸取对照品溶液 0.30，0.50，0.70，0.90，1.10，1.25 mL，分别置5 mL容量瓶中，各加1 mL水摇匀，再加0.5 mL福林试剂，充分摇匀，加入1.0 mL 10%碳酸钠溶液，混匀，以蒸馏水稀释至刻度。分别在60℃下水浴60 min，于760 nm波长处测定各吸光度值。以吸光度值（A）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝0.116 6X+0.096 2，R2＝0.999 5（n＝6）。结果表明，没食子酸质量浓度在 1.2 ～5.0 mg／L范围内与吸光度值线性关系良好。

图1 对照品（DZ01212）和洋葱醇提物（GSP1212）紫外吸收光谱图

稳定性试验：分别取同一供试品溶液0.4 mL，按照洋葱总多酚含量测定的最佳显色条件，显色后室温下放置，分别于 15，30，45，60，90，120 min 时测定吸光度。结果显色后2 h内总多酚含量为30.606 1 mg／g，RSD为0.1149%（n＝6），表明供试品溶液在室温下2h内稳定。

精密度试验：分别精密吸取同一对照品溶液0.4mL，共5份，分别置5mL容量瓶中，按洋葱总多酚含量测定的最佳显色条件，测定吸光度。结果含量为30.640 7 mg／g，RSD为0.137 8%（n＝5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：分别称取洋葱粉末1.0 g，平行16份，精密称定，依法制备供试品溶液，按洋葱总多酚含量测定的最佳显色条件，测定吸光度。结果洋葱总多酚平均含量为 29.908 8 mg／g，RSD为 5.169 4% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别取洋葱粉末6份，精密称取每份1.0 g，各加入一定量的没食子酸对照品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定没食子酸含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 洋葱总多酚加样回收试验结果（n＝6）

2.2 单因素试验

图2 各因素对洋葱总多酚含量测定影响

精密量取供试品溶液 0.4 mL，按 1.2.2项下方法显色，采用单因素优化法分别对体系中福林酚体积（0.25，0.40，0.50，0.60，0.75 mL），10% 碳酸钠体积（0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL），显色温度（30，40，50，60，70 ℃），显色时间（30，40，50，60，70 min）对总多酚含量测定的影响进行考察（以上试验均平行测定3次）。结果见图2。

由图2 A可见，洋葱醇提物的吸光度值随反应温度升高呈先升后降的变化趋势，当反应温度为60℃时，洋葱醇提物的吸光度值最大，反应温度超过60℃后，吸光度值逐渐降低，说明多酚类化合物在高温下不稳定。因此，确定最佳的显色温度为60℃。

由图2 B可见，多酚类物质与显色剂反应需要一个过程，显色反应60 min内，洋葱醇提物吸光度值明显增大，显色反应迅速；反应60 min后，洋葱醇提物吸光度值逐渐下降。因此，确定最佳显色时间为60 min。

由图2 C可见，随着福林试剂用量的增加，洋葱醇提物的吸光度值呈先升后降的趋势，当福林试剂用量为0.5 mL时，吸光度值达最大值。因此，确定福林试剂的最佳用量为0.5 mL。

由图2 D可见，10%碳酸钠溶液是福林酚比色法中反应的缓冲液，能为显色剂与酚类环境提供碱性环境，使多酚与显色剂反应后在碱性环境下显蓝色。可见，洋葱醇提物的吸光度值随碳酸钠溶液加入量的增加而升高，但当加入量超过1.0 mL时，吸光度值迅速降低。因此，确定10%碳酸钠溶液的最佳加入量为1.0 mL。

2.3 正交试验

在单因素试验基础上以显色温度（因素A）、显色时间（因素B）、福林酚体积（因素C）、10%碳酸钠溶液体积（因素D）为考察因素，测定洋葱醇提物中总多酚的含量，优化洋葱醇提物总多酚含量测定的显色条件。设计正交验，其因素水平见表2。

表2 洋葱总多酚含量测定 L9（34）正交试验因素水平表

由表3及表4可见，洋葱总多酚含量测定的最佳显色条件为：显色温度60℃，显色时间60 min，福林酚体积 0.6 mL，10% 碳酸钠溶液体积 0.75 mL。方差分析结果见表3。

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

2.4 抗氧化活性研究

图3 洋葱醇提物抗氧化活性

参考文献［11］方法进行洋葱醇提取物的抗氧化活性试验。结果见图3。可见，在一定质量浓度范围内，洋葱醇提物的抗氧化能力具有浓度依赖性。其中，洋葱醇提物对 ABTS自由基的半数抑制浓度（IC50）值为（187.7±0.08）mg／L，而 阳 性 对 照 芦 丁 对 ABTS 和DPPH 自 由 基 的IC50值 为 （12.87±0.21）mg／L 和（10.29 ± 0.17）mg ／L。

3 讨论

多酚（polyphenols）包括黄酮、酚酸、芪类和木质素等，是植物界中最丰富的次级代谢产物［12］。福林酚法是利用在碱性条件下，多酚类化合物可以将磷钨钼酸还原成蓝色的原理，颜色深浅与多酚含量呈正相关，可用分光光度计进行测定［13］。多酚类物质的抗氧化功能与多酚的结构有关，酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化［14］，是良好的抗氧化剂。酚羟基可提供活泼氢，使自由基灭活，本身被氧化形成含有邻二酚结构的自由基而具有较高的稳定性［15］。

洋葱研究较多的为黄酮，而对多酚的研究相对较少。其中，SIRACUSA等［16］报道洋葱总多酚的含量为123.5 mg／kg（鲜重），且其主要成分为槲皮素 3，4′-二 -O-葡萄糖苷，槲皮素4′-O-葡萄糖苷等。此外，唐远谋等［17］采用微波辅助提取法（MAE），得到洋葱总多酚的含量为 12.45 mg ／g。另外，陈晨等［18］研究了鲜切洋葱贮藏期间多酚成分的变化。本研究中采用UAE法提取洋葱多酚，并采用正交试验法优化其含量测定方法。结果表明，洋葱醇提物具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化能力在一定浓度范围内具有浓度依赖性。

民间洋葱常用于防治动脉硬化症［19］，而氧化应激在动脉粥样硬化病变的发生发展中起着非常重要的作用［20］。因此，本研究为洋葱在保健食品、药品领域中的进一步开发利用提供了参考。