不同分级NSCLC病灶内FoxM1表达的变化及其与增殖、侵袭基因表达的相关性

张静，熊琦，陶海涛，秦博宇，张国庆

非小细胞肺癌(NSCLC)是临床最主要的原发性肺癌病理类型，近年由于体检普及以及影像学检查手段的革新，越来越多的小病灶NSCLC被检出，临床患病率呈迅速上升趋势[1-2]。根据NSCLC病理分级不同，癌细胞的恶性程度也存在较大差异，直接影响治疗方式的选择及最终预后。低分化甚至未分化的NSCLC治疗一直是临床难点，寻找与疾病发生发展密切相关的分子靶点并进行针对性的靶向治疗，成为该病治疗的新思路。FoxM1是对细胞分化、器官发育等多个生命过程均具有调控作用的重要转录因子，已经有研究证实其可直接影响胃癌、食管癌、肝癌等常见肿瘤细胞的恶性生物学行为，推测其是癌细胞恶变过程中的重要靶点之一[3-5]。为了明确FoxM1基因在NSCLC中扮演的角色，现分析不同病理分级NSCLC病灶中FoxM1基因表达及其表达量与癌细胞增殖、侵袭等恶性行为的内在联系，以期为日后NSCLC的靶向治疗提供新思路，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年9月—2018年5月中国人民解放军总医院肿瘤内科接受肺癌根治术后的NSCLC患者118例作为NSCLC组，其中男56例,女62例，年龄47～72(64.37±9.15)岁; 合并高血压35例,糖尿病21例,冠心病15例。取每个NSCLC患者的病灶组织标本作为研究样本，根据病理分级将其分为高分化亚组49例,中分化亚组54例,低分化亚组15例。另取同期在本院进行肺结节切除术，术后病理证实为肺腺瘤的肺良性病变患者50例(病灶标本50个)作为良性组，其中男22例,女28例，年龄44～75(65.01±10.86)岁;合并高血压14例,糖尿病8例,冠心病5例。2组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①NSCLC患者首次确诊,且术前未经保守治疗；②符合肺癌根治术指征；③严格无菌条件下获取并冻存病灶组织，操作过程中无污染；④年龄18～80周岁。(2)排除标准：①合并其他原发恶性肿瘤； ②合并具有恶性生物学行为的良性疾病；③合并全身感染性疾病。

1.3 观察指标与方法 术中病灶切除后即刻留取病灶组织标本1 cm×1 cm，置入冻存管中并放入液氮中冷冻30 min,取出后放置于-80℃冰箱长期保存。

1.3.1 FoxM1基因表达量测定： 采用实时荧光定量PCR法检测各组病灶组织中FoxM1 mRNA表达量，具体操作步骤如下：(1)取冻存标本组织并提取样品RNA；(2)采用紫外吸收法测定RNA质量；(3)采用反转录试剂盒合成样品cDNA，反应条件包括70℃干浴3 min→冰水浴降温至室温→加逆转录酶后37℃水浴60 min→95℃干浴3 min→得到逆转录溶液并冻存于-80℃中；(4)待测样品管家基因实时定量PCR，反应条件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 2 min，共计40个循环；(5)DNA模板制备；(6)待测样品FoxM1基因实时定量PCR，反应条件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min→40个循环后，72℃ 7 min延伸；(7)引物序列: 5'-ATTGCGGTAGCGATGACTGAC，3'-CTAGGTACGAACCTGAGGAAT；(8)电泳明确PCR产物是否为单一特异性扩增条带。上述步骤中涉及的反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均购自上海西唐生物科技公司；所用试剂TRIZOL、氯仿、异丙醇、琼脂糖、EDTA、甲醛等均购自美国Sigma公司。设置良性组病灶中FoxM1基因表达量为标准值100，计算其在NSCLC组病灶中的相对表达量。

1.3.2 NSCLC相关增殖基因、侵袭基因表达量测定：同样采用实时荧光定量PCR法检测NSCLC组、良性组病灶组织中增殖基因(PAX6、HOXB7、EIF5A2、DLC-1、Keap1、PTEN)和侵袭基因(PTTG1、LSD1、TEM8、KLF4、LKB1、RKIP)的mRNA表达量，具体操作步骤同1.3.1项。 上述基因的引物序列见表1。设置良性组病灶中上述基因表达量为标准值100，计算NSCLC组病灶中对应基因的相对表达量。

2 结 果

2.1 不同肺部肿瘤病灶组织中FoxM1基因表达量比较 NSCLC组病灶中FoxM1基因表达量高于良性组(P<0.01)。随分化程度降低, FoxM1基因表达量增加，不同病理分级的病灶组织中FoxM1基因表达量比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 不同肺部肿瘤病灶组织中FoxM1基因表达量的比较

注：与高分化亚组比较，aP<0.01; 与中分化亚组比较，bP<0.01

2.2 不同肺部肿瘤病灶组织中促增殖及增殖抑制基因表达量比较 NSCLC组病灶中增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表达量均高于良性组，增殖抑制基因DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表达量均低于良性组(P<0.01)。NSCLC组中，不同病理分级的病灶组织中上述促增殖及增殖抑制基因表达量比较差异有统计学意义，且随分化程度降低，PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表达量增加，DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表达量减少(P<0.01)，见表3。

表1 NSCLC相关增殖基因、侵袭基因引物序列

表3 不同肺部肿瘤病灶组织中促增殖基因和增殖抑制基因表达量的比较

注：与高分化亚组比较，aP<0.01; 与中分化亚组比较，bP<0.01

表4 不同肺部肿瘤病灶组织中促侵袭基因和侵袭基因表达量的比较

注：与高分化亚组比较，aP<0.01; 与中分化亚组比较，bP<0.01

2.3 不同肺部肿瘤病灶组织中侵袭基因表达量比较 NSCLC组病灶中促侵袭基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表达量高于良性组，侵袭抑制基因KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表达量低于良性组(P<0.01)。NSCLC组中，不同病理分级的病灶组织中上述侵袭基因表达量比较有显著差异，且随分化程度降低，PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表达量增加，KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表达量减少(P<0.01)，见表4。

2.4 相关性分析 相关性分析发现，NSCLC病灶内FoxM1基因表达量与增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表达量呈正相关(r/P=0.419/0.009,0.388/0.013,0.465/0.006)，与DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表达量呈负相关(r/P=-0.347/0.015,-0.417/0.010,-0.503/0.000)；与侵袭基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表达量呈正相关(r/P=0.377/0.016,0.412/0.009,0.509/0.000)，与KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表达量呈负相关(r/P=-0.453/0.003,-0.409/0.010,-0.386/0.019)。

3 讨 论

FoxM1基因属于转录因子家族成员，其在胚胎组织中呈普遍表达、可刺激细胞增殖及有丝分裂，但生理状态下在终末分化的细胞中表达量显著下降[6]。近来研究发现，FoxM1基因的异常激活参与了许多恶性肿瘤的发生发展，同时可使肿瘤临床分期增高、浸润程度增加[7-8]。NSCLC已经成为临床最多见的恶性肿瘤性疾病之一，其发展过程中的关键分子靶点寻找也是疾病研究的最重要课题之一。本研究中NSCLC病灶组织中FoxM1基因表达量大幅高于肺部良性疾病病灶组织，说明FoxM1基因激活也参与NSCLC的发生；同时随NSCLC病理分化程度下降，FoxM1基因表达量呈持续上升趋势，说明FoxM1基因表达上升是导致NSCLC恶性程度增加的直接因素之一。

癌细胞的增殖活性是反映肿瘤恶性程度最直观的指标，检测具体增殖基因表达量可间接反映癌细胞的增殖活力以及肿瘤恶性程度。PAX6、HOXB7、EIF5A2基因在不同研究中被证实可促进NSCLC细胞增殖[9-11]，具体与其加速细胞周期进展直接相关，在肿瘤病灶中普遍存在过表达；而DLC-1、Keap1、PTEN基因则可抑制NSCLC细胞增殖[12-14]，在具体癌症病灶中可发现其表达异常下调。本研究发现NSCLC病灶中PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表达量大幅高于肺部良性病灶，而DLC-1、Keap1、PTEN基因表达量则较低，且在 NSCLC病灶内部，随肿瘤分化程度下降，上述基因表达量的变化趋势更为显著，与既往研究结论基本一致，说明NSCLC细胞存在异常增殖，且随病理分级下降这一异常增殖现状加剧，符合癌细胞的恶性行为学特征。相关性分析指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表达量与PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表达量呈正相关，与DLC-1、Keap1、PTEN基因表达量呈负相关，结合各个基因对癌细胞增殖的作用，可证实FoxM1基因通过促进癌细胞的增殖能力而参与NSCLC病情进展。

与细胞增殖活力相似，癌细胞侵袭性的获得是肿瘤发生淋巴及远处转移的基础，其中伴随着多种与侵袭基因的表达变化[15-16]。PTTG1、LSD1、TEM8基因在不同研究中被证实可促进NSCLC细胞的侵袭能力[17-19]，具体与其促进细胞上皮间质转化过程相关；而KLF4、LKB1、RKIP基因则属于典型的抑癌基因，在恶性肿瘤组织中呈低表达甚至表达缺失[20-22]，由于其对癌细胞的恶性行为抑制不足从而间接促进肿瘤进展。本研究发现NSCLC病灶中PTTG1、LSD1、TEM8基因表达量呈异常增加，而KLF4、LKB1、RKIP基因表达量异常下降，且随肿瘤病理分化程度下降上述基因表达量变化程度更显著，明确了NSCLC细胞侵袭力的变化趋势。相关性分析进一步指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表达量与PTTG1、LSD1、TEM8基因表达量呈正相关，与KLF4、LKB1、RKIP基因表达量呈负相关，证实FoxM1基因还可以通过促进癌细胞的侵袭能力而参与NSCLC病情进展。

综上所述， NSCLC病灶内FoxM1基因表达量异常增加，且随病理分化程度下降其表达量进一步上升。FoxM1基因表达量与NSCLC相关增殖及侵袭基因表达量直接相关，可能由此参与疾病的发生发展。

利益冲突：无

作者贡献声明

张静:负责研究构思、选择课题、课题设计、论文撰写；熊琦、陶海涛、秦博宇:负责数据获取、统计分析并参与撰写；张国庆:负责研究方案指导、论文修改