雌二醇对高眼压大鼠眼压、视网膜厚度及凋亡、自噬基因表达的调节作用

郭立斌，胡运韬，何凯，王晶，许洋洋

青光眼是以眼压升高为特征的致盲性眼病，视网膜神经节细胞凋亡和自噬过度、视网膜神经层及视神经萎缩是主要的病理特征，患者可逐步出现视野缺损、视力减退，直至失明[1-2]。高眼压在青光眼的病情发展变化过程中起到至关重要的作用，降眼压是临床上治疗青光眼的重要手段，在此基础上需要保护视网膜神经节细胞以达到改善视网膜神经层厚度及视神经功能的作用，进而最大限度地保护青光眼患者的视力。雌激素不仅在女性生殖系统中发挥作用，还能在心脏、大脑等组织中发挥细胞保护作用[3-4]。已有研究报道雌激素在高眼压动物模型中能够减少视网膜神经节中的细胞凋亡数目[5-6]，但关于雌激素调节眼压水平的研究结果并不一致，也缺乏雌激素对视网膜中凋亡、自噬基因表达的影响。为了进一步明确雌激素在高眼压病理进程中的治疗作用，本研究具体分析了雌二醇(E2)对高眼压大鼠眼压、视网膜厚度及凋亡、自噬基因表达的调节作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：SD大鼠24只,雄性, 3月龄，体质量200～250 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号SYXK2017-002，饲养温度20～25℃、相对湿度50%～70%；经裂隙灯检查、眼部正常、无明显疾病。(2)试药试剂：E2、丝裂霉素购自Sigma公司，4%多聚甲醛、苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天公司，总RNA提取试剂盒、FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒、Talent荧光定量检测试剂盒购自北京天根生物公司。(3)仪器设备：TonoLab型眼压仪购自Tiolat公司，显微镜购自Nikon公司，裂隙灯购自北京拓普康医疗器械有限公司。

1.2 高眼压模型建立 2016年3月—2018年6月在广东省医学实验动物中心进行动物实验，SD大鼠随机数字表法分为对照组、高眼压组、E2组，每组8只。高眼压组和E2组大鼠予5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，再行右眼角结膜表面麻醉，在显微镜下剪开球结膜并对上巩膜静脉进行电凝闭合，同时放置浸润了0.2 g/L的丝裂霉素C棉片。造模后第2天测定眼压，若造模后眼压稳定大于造模前5 mmHg则认为造模成功。对照组仅进行右眼角结膜表面麻醉，不进行其他特殊处理；E2组从造模后当天开始进行药物干预，皮下注射100 μg/kg的E2(以植物油稀释溶解)，隔天1次；高眼压组给予等剂量植物油皮下注射，隔天1次。

1.3 观测指标与方法 (1)眼压测定：造模前及造模后1周、2周、3周、4周时，分别采用眼压仪测定眼压水平。(2)视网膜厚度、视神经纤维厚度测定：造模4周后，过量麻醉处死大鼠并立即摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h后进行石蜡包埋、制作病理切片。采用HE染色试剂盒对切片染色后在显微镜下观察，测量视网膜厚度、视神经纤维厚度。(3)凋亡及自噬基因表达测定：取石蜡包埋的视网膜组织，采用总RNA提取试剂盒提取视网膜内RNA，采用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒将RNA合成为cDNA，取cDNA样本2 μl与Talent荧光定量检测试剂盒内的检测液10 μl、引物0.8 μl 、去离子水7.2 μl 混合成PCR反应体系，按照95℃ 15 s、60℃ 20 s、72℃ 25 s反应40个循环，根据扩增曲线得到循环阈值(Ct)，按照公式2-ΔΔCt计算mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 3组大鼠眼压水平比较 造模前，3组大鼠眼压水平比较无明显差异(P>0.05)；与造模前比较，对照组大鼠眼压水平无明显变化(P>0.05)，高眼压组和E2组造模后1～4周时眼压水平均明显升高(P<0.01)，且均明显高于对照组(P<0.01)，但E2组眼压水平与高眼压组比较无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.2 3组大鼠视网膜厚度、视神经纤维厚度比较 造模后4周时，视网膜厚度、视神经纤维厚度比较，高眼压组

表1 3组大鼠造模前后眼压水平比较

表3 3组大鼠造模4周后视网膜中凋亡基因表达量比较

表2 3组大鼠造模后4周视网膜厚度、视神经纤维厚度比较

2.3 3组大鼠视网膜中凋亡基因表达量 造模4周后，视网膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的mRNA表达量比较，高眼压组>E2组>对照组，Bcl-2的mRNA表达量高眼压组

2.4 3组大鼠视网膜中自噬基因表达量 造模4周后，与对照组比较，高眼压组视网膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的mRNA表达量高眼压组均明显高于E2组高于对照组(P均<0.05) ，见表4。

表4 3组大鼠造模4周后视网膜中自噬基因表达量比较

3 讨 论

高眼压是青光眼病程中的特征，持续存在的高眼压能够通过引起视网膜神经节细胞的凋亡来导致视力水平减退。因此，治疗青光眼不仅需要降眼压，还需要减轻视网膜神经节细胞的凋亡。马雪云等[5]和李贞等[6]均报道了雌激素用于高眼压动物模型的价值，能够减少视网膜神经节细胞的凋亡，但雌激素对高眼压动物模型眼压水平影响的结果并不一致，马雪云的研究认为雌激素能够使高眼压动物模型的眼压水平降低，而李贞的研究认为雌激素对高眼压动物模型的眼压水平无明显影响。本研究对高眼压组大鼠眼压水平的分析发现：高眼压组大鼠造模后的眼压水平明显高于对照组，由此提示高眼压模型大鼠建立成功、眼压水平明显升高。在使用E2对高眼压模型大鼠进行干预后发现：E2组大鼠的眼压水平明显高于对照组且与高眼压组比较无明显变化。与李贞的研究结果一致，说明E2本身并不直接影响高眼压模型大鼠的眼压水平、不具备直接的降眼压作用。

青光眼病程中持续高眼压能够损害视网膜神经节，并逐步引起视觉功能损害、严重者会发生失明。在高眼压引起视网膜神经节损害的过程中，组织学上表现为视网膜厚度及视网膜神经层厚度的丢失，这一组织学表现与视力水平下降、视野缺损的临床表现相互吻合[7-8]。本研究对高眼压组大鼠视网膜厚度及视神经纤维厚度的分析发现：高眼压组的视网膜厚度及视神经纤维厚度均明显低于对照组。E2在多种组织脏器中具有细胞保护作用，脑梗死以及脊髓压迫模型中被证实能够保护神经元细胞，本研究在使用E2干预后观察了高眼压模型大鼠视网膜厚度及视神经纤维厚度的变化，E2组的视网膜厚度及视神经纤维厚度均明显高于高眼压组。这一结果表明E2能够在高眼压过程中增加视网膜厚度及视神经纤维厚度、具有视网膜的保护作用。

在高眼压引起视网膜内细胞凋亡的过程中，线粒体凋亡途径是发挥关键作用的凋亡机制[9]。Bcl-2/Bax是一对调节线粒体途径凋亡的上游分子，两者能够通过在线粒体膜上形成同源二聚体或异源二聚体的方式来影响线粒体膜对细胞色素C的通透性，Bax所形成的同源二聚体能够促进细胞色素C的释放，Bcl-2与Bax所形成的异源二聚体则能阻碍细胞色素C的释放[10-11]。由线粒体释放进入胞浆的细胞色素C能够首先激活Caspase-9，进而通过一系列级联放大反应来使Caspase-3激活，最终通过活化的Caspase-3来介导细胞凋亡[12-13]。本研究对视网膜中线粒体凋亡基因的分析发现：高眼压组视网膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达量明显升高，Bcl-2的表达量明显降低；在用E2干预后，E2组视网膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达量明显降低，Bcl-2的表达量明显升高。这一结果表明高眼压能够激活视网膜内的线粒体途径的凋亡，E2干预能够调节Bcl-2/Bax、阻碍线粒体途径的凋亡。

细胞自噬是近年来新发现的细胞死亡方式，又被称为“Ⅱ型细胞凋亡”。在细胞经历外界伤害性刺激的过程中，适度激活自噬能够通过清除细胞内错误折叠蛋白、受损细胞器的方式来增加细胞供能，有利于细胞耐受伤害性刺激；但持续激活的自噬不仅不会为细胞供能，还会加重细胞的损伤[14-15]。mTORC1是mTOR通路中的关键信号分子，能够为细胞自噬提供上游信号，通过下游Beclin1和LC3-II来促进自噬小体的形成，进而激活细胞的自噬过程并通过持续存在的自噬来引起细胞损伤[16-17]。本研究对视网膜中自噬基因的分析发现：高眼压组视网膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表达量明显升高；在用E2干预后，E2组视网膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表达量明显降低。这一结果表明高眼压能够激活视网膜内的细胞自噬，E2干预能够阻碍细胞自噬。

综上所述，雌二醇虽然对高眼压大鼠的眼压水平无明影响，但是能够增加视网膜及视神经纤维厚度、抑制视网膜内的细胞凋亡及自噬，因而使用E2治疗青光眼能够起到保护视网膜的作用，有利于阻碍青光眼病程中视觉的损害。

利益冲突：无

作者贡献声明

郭立斌：负责研究设计、动物实验及论文撰写；胡运韬：负责研究指导、论文修改；何凯：参与动物造模及眼压、视网膜厚度、视神经纤维厚度的测定；许洋洋、王晶：参与各基因表达的测定