环氧合酶-2和磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶在扁平苔藓皮损中的表达

王 娟 白 莉 赵一锦 鲍海平 米希婷

扁平苔藓(lichen planus，LP)是一种T细胞介导的慢性炎症性皮肤病，发病机制尚未探明，既往研究发现皮损中角质形成细胞存在异常增殖与凋亡现象，血管密度增加[1-3]。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的关键限速酶，多种应激和前炎性信号可诱导其表达，参与炎症反应、细胞增殖分化、血管形成和肿瘤浸润等病理过程。国外学者报道，皮肤扁平苔藓皮损处COX-2mRNA和COX-2主要产物前列腺素E2(PGE2)的表达水平明显高于非皮损处，同时皮损和非皮损处的表达均比正常皮肤组织显著升高，认为COX-2和PGE2通过促进树突状细胞迁移、活化和激活Th1、Th17免疫应答系统，参与扁平苔藓的发病[4]，目前国内未见相关报道。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)介导了COX-2表达与前列腺素合成的信号传导，其家族成员P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)是调控COX-2表达的上游激酶。为研究扁平苔藓皮损中COX-2及其上游调控分子的表达情况，我们对皮损中COX-2和p-P38MAPK的表达强度进行了检测，探讨其在扁平苔藓发病中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 病例组20例，选自2016年1月至2017年12月就诊于我院皮肤科的扁平苔藓患者皮损标本，均经临床和病理确诊，包括男12例，女8例，年龄25～68岁，平均(37.94±3.86)岁，病程3～30个月，平均病程(15±4.7)个月。其中慢性局限性11例、线状4例、泛发性3例、肥厚性2例。取材自四肢和躯干。同时半年内局部或全身未使用过糖皮质激素或免疫抑制剂类药物，无其它皮肤病或系统疾病。对照组20例正常皮肤组织标本，均取自整形外科健康皮肤，男、女各10例，年龄21～66岁，平均(36.48±4.31)岁。两组在性别、年龄上比较，差异均无统计学意义。

1.2 主要试剂 兔抗人COX-2单克隆抗体、兔抗人p-P38MAPK单克隆抗体(Cell Signaling公司)，即用型二步法检测试剂盒PV-9000(GBI公司)，二氨基联苯胺(DAB)试剂(Sigma公司)。

1.3 免疫组化法 步骤如下：石蜡标本连续切片至4 μm，脱蜡水化；3% H2O2溶液孵育25 min消除内源性过氧化物酶的活性；枸橼酸钠缓冲液抗原热修复；分别滴加稀释的一抗：COX-2(1∶200)和p-P38MAPK(1∶250)，空白对照采用PBS代替一抗；滴加二抗试剂；然后DAB显色，苏木素复染、脱水、封片。

1.4 结果判定 以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张标本随机选择5个高倍视野(×400)，采用MIAS-2000图像分析系统测定染色区域的积分光密度值(integrated optical density，IOD)，取均值为该标本的IOD值，由专人负责测定，测定前背景校正，保持每张标本参数设置一致。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间比较进行t检验，指标间相关性采用Pearson相关分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 免疫组化结果 COX-2阳性染色定位于胞质，p-P38MAPK定位于胞质和(或)胞核。在扁平苔藓皮损中，COX-2和p-P38MAPK阳性细胞主要分布于表皮基底层和棘层，染色呈棕黄色，部分真皮淋巴细胞也有表达(图1)；在正常皮肤组织中，二者均呈弱阳性或阴性表达(图2)。两组间IOD均值比较，差异均有统计学意义(表1)。

2.2 相关性分析 扁平苔藓皮损中COX-2与p-P38MAPK的表达呈正相关(r=0.62，P<0.01)。

图11a、1b分别为COX-2和p-P38MAPK在扁平苔藓组织中的表达(免疫组化，×100)图22a、2b分别为COX-2和p-P38MAPK在正常皮肤组织中的表达(免疫组化，×100)

表1 COX-2和p-P38MAPK在扁平苔藓和正常皮肤的表达

3 讨论

COX-2是花生四烯酸代谢过程中重要的限速酶，属于诱生型蛋白酶，生理状态下基本不表达，当细胞受到炎症介质、致癌因子或生长因子刺激时表达上调[5]。研究发现上皮细胞的增殖离不开COX-2的调控[6]，在皮肤肿瘤、银屑病和口腔扁平苔藓皮损中都有COX-2的表达，不仅通过前列腺素等炎性因子参与炎症反应，而且可上调血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)的表达，促进血管形成、细胞过度增殖[7-9]。在银屑病、口腔扁平苔藓皮损中均发现COX-2和VEGF的表达呈正相关[8，9]。笔者运用免疫组化法检测扁平苔藓皮损，发现COX-2的表达水平明显高于正常皮肤组织，既往我们发现VEGF在皮损中亦高表达，二者表达位置一致[2，3]，提示COX-2和VEGF可能存在正向调控关系，共同参与了扁平苔藓的发病，推测在炎症环境下，COX-2表达增多，通过其催化产物PGE2参与局部炎症反应、促进角质形成细胞增殖分化，同时上调VEGF表达，促进新生血管形成，加重炎细胞浸润，为过度增殖的角质形成细胞提供营养供给。

MAPK是细胞内一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活后经胞内一系列蛋白磷酸化修饰引起酶的级联反应，将细胞外刺激信号传导至细胞及其核内，调节细胞周期运行和炎症反应，其介导的信号通路是细胞分裂增殖最重要的途径之一。P38MAPK是MAPK家族的主要成员之一，在静止细胞内，以非活化的形式存在于细胞质与(或)细胞核，一旦被磷酸化激活，即移位于细胞核，控制多种转录因子的基因表达。本研究发现p-P38MAPK在正常皮肤组织的表皮细胞胞质和胞核少量表达，而在扁平苔藓皮损中表现出明显的亲核性，大量表达于胞核，提示其介导的信号通路被激活，发挥生物学效应。

研究发现P38MAPK信号系统可通过控制转录，上调COX-2的表达，磷酸化的P38MAPK是介导信号传递的活性物质，抑制P38MAPK活化可减轻COX-2介导的炎症反应[10]。一方面活化的P38MAPK入核后激活NF-κB，后者通过与COX-2启动子相应位点结合，启动COX-2基因的扩增[11]；另一方面，P38MAPK尚可通过调节活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)促进COX-2基因转录，抑制NF-κB和AP-1的活性均可拮抗COX-2的表达[12]。笔者发现在扁平苔藓中COX-2和p-P38MAPK的表达呈正相关，提示COX-2的表达可能受到上游P38MAPK信号系统的调控，二者协同作用，我们推测在扁平苔藓发病中，外界刺激信号激活P38MAPK信号系统，经胞内一系列酶联反应，将信号传入核内，激活核转录因子NF-κB、AP-1，继而促进COX-2、cyclinD1等基因的表达，参与皮损中炎症反应进程和角质形成细胞的异常增殖，导致扁平苔藓病变的产生。但是COX-2的表达受多个信号通路调控，可能具有组织和细胞特异性，故扁平苔藓中COX-2的表达调控机制尚需进一步研究。