鼠神经生长因子抗C57BU/6J小鼠毛细胞凋亡与保护作用的研究

老年性耳聋是指随年龄增加而逐渐发生的以高频听力下降为主的感音神经性耳聋。随着我国逐渐步入老龄化社会，老年性耳聋发病率逐年增高，同时由于神经性耳聋治疗效果欠佳，老年性耳聋已经成为老年人生活质量下降的重要原因之一。目前老年性耳聋的发病机制尚未完全阐明，研究显示毛细胞和螺旋神经节细胞发生凋亡可能是重要的分子机制。鼠神经生长因子(NGF)对听觉上皮、听觉神经元细胞的增殖分化、活化及发育成熟起着重要作用，而且对损伤后残存神经元起着修复和保护作用。本研究以具有退变性耳聋病变特征的C57BU/6J小鼠作为实验对象，注射NGF后检测NGF及caspase-3在基膜的免疫印迹表达情况，探究NGF对耳蜗毛细胞凋亡的逆转作用，从而评价NGF对内耳毛细胞是否起到保护作用，为临床治疗提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 动物模型 选择C57BU/6J小鼠作为研究对象[1]，C57BU/6J小鼠具有退变性耳聋病变的特征，该种系小鼠耳蜗毛细胞在成年早期开始蜕变，随年龄增长，听力损失符合感音性老年性耳聋的变化规律，符合研究要求。健康C57BU/6J小鼠购自北京维通利华公司，分别将C57BU/6J小鼠分为对照组、3周龄处理组、12周龄处理组，每组12只，雌雄不限，单笼饲养IVC系统中。

1.2 试剂与方法 鼠神经生长因子(恩经复)购自厦门未名生物医药有限公司。处理组给予腹腔注射鼠神经生长因子，每次6 kU，1次/日，持续1周，对照组以同样方法注射生理盐水。重组NGF抗体购于美国CST公司，兔抗caspase-3多克隆抗体购自英国Abcam公司，HRP直标GAPDH抗体购自康为世纪生物科技有限公司。预制胶购置于上海翊圣公司。

1.3 耳蜗基膜制备 麻醉下处死小鼠，将小鼠耳蜗取出，放置于冰盘上的无菌玻璃皿中，剔除听泡、听骨、鼓膜，迅速剥离基膜后用于总蛋白提取。

1.4 总蛋白和Western Blot提取方法 基膜置于1.5 mL组织匀浆器中，加入裂解液RIPA、PMSF、NaF(100∶1∶1)，研磨30 min 至组织透亮、无颗粒，静置10 min，吸出组织液至1.5 mL离心管，然后4 ℃离心机12 500 r/min，离心30 min，小心吸取上清，置于0.5 mL离心管中，于-80 ℃保存备用。

Western Blot提取法：取出蛋白，用酶标仪测出蛋白浓度，根据上样质量来计算上样体积，按量加入蛋白等，在沸水中煮5 min；预制胶上胶架，点样后电泳，刚开始60 V后转至120 V；转膜，100 V，45 min；封闭，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h；剪膜，加入一抗孵育过夜， 复温1 h；洗膜， TBST 清洗1次10 min，共3次；加入二抗，HRP标记的IgG二抗(1∶10 000)；洗膜，TBST清洗1次10 min，共3次；加入1×TBS；显影，用ECL化学发光检测试剂盒显影。其中兔抗caspase-3多克隆抗体(1∶1 000)，重组NGF抗体(1∶1 000)。

2 结 果

2.1 NGF在C57BU/6J小鼠耳蜗组织中的表达 经Western Blot检测，NGF蛋白在实验组C57BU/6J小鼠耳蜗中的表达相对倍数为(0.36±0.19)，低于3周龄处理组的(0.84±0.20)和12周龄处理组的(0.73±0.26，P<0.001)。3周龄处理与12周龄处理组相比，NGF蛋白的表达无统计学意义(P=0.218)。详见图1。

A为NGF蛋白分别在对照组、3周龄处理组、12周龄处理组小鼠中的表达；B为NGF蛋白分别在各组中相对灰度倍数(经内参GAPDH校正)

2.2 Caspase-3在C57BU/6J小鼠耳蜗组织中的表达 经NGF注射处理后，经Western Blot检测caspase-3在各组中的表达，对照组该蛋白相对表达倍数为(6.76±2.91)，分别高于3周龄处理组的(2.43±2.59，P<0.001)和12周龄处理组的(2.12±1.79，P<0.001)，3周龄处理组与12周龄处理组相比差异无统计学意义(P=0.772)。详见图2。

A为caspase-3蛋白分别在对照组、3周龄处理组、12周龄处理组小鼠中的表达；B为caspase-3蛋白分别在各组中相对灰度倍数(经内参GAPDH校正)

3 讨 论

鼠神经生长因子是从小鼠颌下腺分离纯化出的细胞生长因子，是一种相对分子质量为265 000 kD的生物活性蛋白[2]。NGF兼有神经营养因子与促进神经突起生长因子双重作用，对神经细胞的生长发育、分化、再生发挥着调节作用[3-5]。景阳等[6]经鼓膜穿刺局部使用鼠神经生长因子通过蜗窗膜后，在内耳淋巴液中维持较高的浓度，达到营养神经的功能，促进内耳的功能恢复。在神经系统遇物理、化学等多种损害时，外源性神经生长因子可以保护感觉神经元和交感神经元，减轻伤害的程度，促进再生神经纤维生长，有利于神经功能的恢复。因此，NGF对损伤后的中枢神经系统神经元有保护作用，可防止因损伤导致的神经元萎缩与死亡，促进中枢神经系统损伤后神经功能恢复[7]。本实验通过小鼠腹腔注射NGF后，发现处理组中不同周龄小鼠耳蜗组织内NGF的表达均增高，且与对照组相比差异有统计学意义，说明小鼠腹腔注射NGF后可弥散到达耳蜗。

老年性耳聋具体的发病机制尚未完全阐明，目前研究认为主要与内耳微循环缺血缺氧、毛细胞和螺旋神经节细胞凋亡和坏死[8-11]等有关。细胞凋亡是细胞在死亡信号刺激后发生的一系列级联激活的主动性细胞死亡过程。Caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，Caspase-3是其中主要的效应者分子，在细胞凋亡机制网络中居中心地位[12-15]。检测caspase-3的表达情况，有助于评价NGF是否对毛细胞发挥抑制凋亡并起到保护作用。本实验发现，注射NGF后的小鼠基膜中，对照组caspase-3蛋白表达显著低于NGF处理组，提示注射NGF后可以抑制毛细胞凋亡，从而发挥一定的保护作用。

综上所述，NGF注射后可提升小鼠耳蜗基膜中该蛋白的表达，通过降低耳蜗组织中caspase-3的表达，抑制老龄大鼠内耳毛细胞凋亡而发挥相应保护作用，为临床治疗提供理论支撑。