基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的研究

马培泽，孙正新2，杨 春，姜月华3，吕 娟

细胞在应激状态下，适度的自噬能够促进细胞自我吞食，保护细胞抵抗不利环境，促进细胞存活，而过度自噬则诱导细胞走向程序性死亡[1-4]。心肌缺血时，自噬活性的改变很可能影响血管内皮的结构和功能，而血管内皮细胞功能改变与心血管疾病的发生发展密切相关，因此，研究自噬在缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血损伤中的作用，将有助于发现新的方法应用于缺血性疾病的治疗。过去的研究多集中于对心肌细胞的保护，而忽视了对CMECs缺血损伤的关注。迄今为止，自噬在缺血CMECs的作用尚未明确，基于细胞自噬探讨中医药保护血管内皮的作用，鲜见报道。鉴于此，本课题在原有研究基础上，建立缺血CMECs模型，基于细胞自噬探讨中医药保护血管内皮的干预效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF级6周龄雄性SD大鼠，体重220～280 g，45只，由山东鲁抗医药股份有限公司提供。所有大鼠均采用笼养，生存在明暗各12 h饲养环境中。

1.2 主要仪器 流式细胞仪(德国Beckman公司)，酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，低温高速离心机(美国Thermo Scientific公司)，透射电镜(日本JEOL公司)，CO2培养箱(美国Heraeus公司)，心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司)，呼吸机(美国BIRD公司)，BIO-RAD电泳仪(美国BIO-RAD公司)，Axiovert 40C倒置相差显微镜(德国Zeiss公司)，BIO-RAD半干转膜仪(美国BIO-RAD公司)，LAS-4000型化学发光及荧光影像分析仪(日本FUJIFILM公司)。

1.3 药品与试剂 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科生物有限公司)，3甲基腺嘌呤(3-MA，美国Sigma-Aldrich)，雷帕霉素(美国Cell Signal Technology)，祛风生脉颗粒(北京康仁堂药业有限公司)，DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，PBS平衡液(上海碧云天生物技术有限公司)，0.25%胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，Western-blot所用试剂(北京Solarbio公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物灌胃及血清制备 选取雄性SD大鼠(220～280 g)5只。祛风生脉颗粒2 g/(kg·d)，每只大鼠每日上午灌胃1 次，每次4 mL，连续5 d。于第5日末次灌胃3 h 后打开腹腔，在大鼠腹主动脉插管，无菌取血，置无菌不抗凝管中，室温下静置3～4 h，1 500 r/min离心20 min，吸上清液，无菌分离血清并混合，过滤后置于无菌试管中，制备成祛风生脉颗粒大鼠含药血清，于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 大鼠急性心肌梗死模型建立 选取雄性SD大鼠(220～280 g)32只，采用结扎法制作大鼠急性心肌梗死模型[5]。记录心电图出现Q波、ST段抬高、T波高耸或倒置，证实结扎成功。术后存活24 h即为造模成功。

1.4.3 培养大鼠缺血/正常CMECs 选取造模成功的急性心肌梗死模型大鼠32只及正常SD大鼠8只，采用组织块法分别培养大鼠缺血/正常CMECs[5]。组织块周围培养出大量细胞，去除组织块，继续培养，3 d换液1次，直到细胞生长至近融合时进行传代，实验均选取二代细胞进行。

1.4.4 分组及药物干预 将成功培养的大鼠缺血CMECs随机分为4组：缺血组(QX组)、缺血+雷帕霉素组(QX+RAPA组)、缺血+3-甲基腺嘌呤组(QX+3-MA组)和缺血+祛风生脉颗粒组(QX+QF组)。并将正常大鼠CMECs作为正常组(ZC组)。QX组和ZC组细胞均给予含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，QX+RAPA组在上述培养基基础上，加入浓度为10 nmol/L的自噬促进剂雷帕霉素，QX+3-MA组加入浓度为5 mmol/L的自噬抑制剂3-MA，QX+QF组给予祛风生脉颗粒大鼠含药血清，与缺血CMECs共孵育，培养24 h。

1.5 观察指标及测定方法

1.5.1 透射电镜观察自噬小体 取各组处于对数生长期的细胞，倒置相差显微镜下观察细胞长满培养瓶底的80%，消化、离心，小心吸取上清液，向细胞团块中缓缓加入1.5 mL 3%戊二醛固定液进行固定，4 ℃保存，后进行双固定、脱水、浸透、包埋、切片，调试电镜，观察自噬小体以及细胞超微结构变化。

1.5.2 Western-blot分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表达 与上述分组一样，分别取5组生长至对数生长期的细胞，弃培养液，PBS洗涤后加入细胞裂解液，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度[3]，根据总上样量和各组样本蛋白浓度计算各组样本所需样本量。将样品液和预染蛋白标记分别上样，电泳分离蛋白，参照半干转膜仪说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，转印蛋白，于5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h以封闭膜上的非特异结合，封闭过的膜加入合适浓度一抗，抗原抗体结合，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗以结合一抗，室温孵育1 h，加入显色剂，膜与化学发光底物孵育，应用LAS-4000型化学发光及荧光影像分析仪曝光显影，图片扫描。应用Gel-Pro软件分析数字化图像上每个特异条带的灰度值。各组样本目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得数值为各组样本目的蛋白的相对含量。

1.5.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 0.25%胰酶消化细胞，将每个样本细胞数调整为1×106～5×106个，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤2次，1000 r/min离心5 min，弃上清，每个样本用约500 μL的1×Binding Buffer重悬细胞；每个样本中分别加入5 μL的Annexin V-FITC和106的PI；避光摇匀后黑暗中室温孵育5 min；1 h内通过流式细胞仪检测分析结果。

1.5.4 酶联免疫吸附法检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1) 加药干预后用无菌EP管收集各组细胞培养上清液，按照酶联免疫试剂盒说明书稀释标准品。取5支干净的EP管，并于每管中加入150 μL的标准品稀释液，分别设空白孔(不加样，只加显色剂A、B和终止液)、标准孔、待测样品孔和零孔(将其作为标曲的最后一个点)，并做记录。标准品孔：每孔加入制备好的标准品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。样品孔：先加入相应大鼠血清样品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。零孔：先加入标准品/样品稀释液50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。以上各孔均做好相应记录，轻轻摇晃后贴上封板膜，置于37 ℃恒温箱中60 min。轻轻揭掉封板膜，弃去液体，甩干，放入洗板机内洗板，洗板5次后取出酶标板，拍干。每孔中先后分别加入显色剂A 50 μL、显色剂B 50 μL，小心摇晃，置于37 ℃保温箱中避光10 min。取出酶标板，每孔加入终止液50 μL以终止反应(蓝色立即转为黄色)。将酶标板放入酶标仪中，以空白孔调零，波长为450 nm测量各孔的吸光度值(此步骤应于10 min内进行)。根据标准品的浓度和吸光度值计算出标准曲线回归方程，在此基础上根据样品的吸光度值计算出不同样品所对应的浓度。

2 结 果

2.1 透射电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化 透射电镜下，ZC组细胞质均匀，细胞内空泡少，核染色质均匀分布；QX组细胞质内可以见到大小不等的双层膜或多层膜自噬体结构，线粒体形态肿胀变形；QX+RAPA组自噬体的聚集趋于增多，自噬体中包含部分细胞质成分，QX+3-MA组自噬体数目明显减少。QX+QF组自噬小体聚集更加明显，同时还观察到数目较多的自噬溶酶体，自噬溶酶体中包含部分胞质成分以及尚未消化的细胞器。详见图1。

A为ZC组；B为QX组；C为QX+RAPA组；D为QX+3-MA组；E为QX+QF组。图中白色箭头所示为核仁，黑色实心箭头所示为自噬小体，黑色空心箭头所示为自噬溶酶体

2.2 各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情况比较 Western blot 结果表明：QX组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于ZC组和QX+3-MA组(P<0.05)；与QX组和QX+3-MA组比较，QX+RAPA组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值进一步升高(P均 <0.05)，与QX组相比，QX+QF组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(P<0.01)。详见表1。

表1各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情况(±s)

与ZC组比较，1)P<0.05；与QX组比较，2)P<0.05；与QX+3-MA组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3 各组细胞凋亡情况比较 QX组总凋亡率高于ZC组(P<0.05)；与QX组和QX+3-MA组比较，QX+RAPA组总凋亡率明显降低(P均<0.05)，与QX组相比，QX+QF组总凋亡率显著降低(P<0.01)。详见图2、表2。

图2流式细胞仪检测细胞凋亡情况

表2各组CMECs凋亡情况比较(±s) %

与ZC组比较，1)P<0.05； 与QX组比较，2)P<0.05；与QX+3-MA组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各组细胞内皮功能变化 QX组ET-1水平比ZC组升高(P<0.01)；QX+RAPA组ET-1水平比QX组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；QX+3-MA组ET-1水平比QX组升高(P<0.05)；QX+QF组ET-1水平比QX组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。QX组NO水平比ZC组升高(P<0.01)；QX+RAPA组NO水平比QX组降低(P<0.05)；QX+3-MA组NO水平比QX组升高(P<0.05)；QX+QF组NO水平比QX组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

表3各组细胞内皮功能变化比较(±s)

与ZC组比较，1)P<0.01；与QX组比较，2)P<0.05；3)P<0.01

3 讨 论

“损伤反应”学说认为，血管内皮细胞损伤是冠心病心肌缺血发生的始动环节。然而，目前对于CMECs缺血损伤的关注远远少于心肌细胞本身。

自噬作为细胞应对损伤的一种保护性反应，对维持细胞内环境的稳定及生理功能有着非常重要的作用[6-9]。推测自噬可能是防止血管内皮缺血损伤的一种潜在机制，有可能成为心血管疾病治疗的新靶点和新策略。Xie等[10]用AGEs修饰的牛血清白蛋白AGEs-BSA培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，发现AGEs-BSA 在作用早期可以提高 HUVECs 的自噬水平而抵抗损伤。Han等[11]发现预孵育姜黄素能诱导HUVECs自噬，显著增加过氧化氢处理HUVECs的生存能力。张艳林等[12]用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激内皮细胞后发现ox-LDL可诱导细胞自噬，同时乳酸脱氢酶(LDH)和ET-1的分泌增加说明细胞受到损伤，而这种损伤可被自噬诱导剂雷帕霉素所降低，被自噬抑制剂3-MA所增强，提示自噬在ox-LDL导致的内皮细胞损伤中起保护作用。本研究发现，缺血CMECs能够发生自噬，但是细胞凋亡增加，内皮功能受到损伤，雷帕霉素干预后的缺血CMECs，电镜下观察到自噬小体数目增多，细胞凋亡减少，内皮功能得到改善，缺血CMECs的自噬流是受到抑制的，整个自噬过程是存在障碍的，这种障碍很有可能发生在自噬溶酶体的环节。

根据冠心病“本虚标实”的基本病机，结合戴国华教授提出的冠心病“风病”学说，认为心肾阳虚、气血失调是冠心病发病的基础，风邪是冠心病重要的致病因素，脉滞风阻是冠心病发作的关键病理环节。确立了祛风活血通络、补肾益气生脉的治疗方法，研制成中药祛风生脉颗粒，从风邪论治冠心病有着丰富的临床经验，且对安全性的顾虑较少。用祛风生脉颗粒大鼠含药血清，与缺血CMECs共孵育，电镜下观察到自噬小体数目明显增多，同时观察到较多的自噬溶酶体，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高，细胞总凋亡率明显减少，ET-1水平降低(P<0.01)，提示祛风生脉颗粒干预后不仅促进了自噬小体的生成，而且促进了整个自噬流，包括自噬溶酶体的生成，达到减少细胞凋亡，改善内皮功能的干预效应。至于祛风生脉颗粒调控自噬的分子机制，尚需要进一步深入研究。