二乙基亚硝胺诱导的肝癌模型大鼠尿液代谢组学研究

米热阿依·亚力昆，迪那拉·恰热甫汗，阿合尔扎马尼·麦麦提，巴哈古力·阿卜都热合曼，太力艾提·吐尔洪，巴吐尔·买买提明

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 830011)

肝细胞性肝癌简称肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC),近20 年病死率逐年升高[1-2]。肝癌发病率高、死亡率高，预后极差，在癌症相关死亡率中位居第3位。数据显示，80%的肝癌患者由肝硬化转化而来，乙肝、丙肝、酗酒、黄曲霉素和化学致癌剂的接触是其发病的主要原因[3-4]。其中化学致癌剂引起的肝癌占一定比例，而亚硝胺类诱导剂二乙基亚硝胺溶液(DEN)致癌率较高，是建立肝癌模型中常用的化学诱导剂[5-7]。DEN诱导肝癌的动物模型与临床患者的组织学和遗传学特征相似，此方法在肝癌模仿过程中较常用[8]。

代谢组学是研究体内代谢产物的系统生物学方法，能为疾病状态、药理毒理和基因功能的研究提供大量信息[9-10]。目前，有研究利用代谢组学寻找肝癌的潜在生物标志物，在肝癌的研究领域取得了成果[11]。

本研究采用DEN诱导大鼠肝癌模型，采用核磁共振波谱技术(1H-NMR)分析模型大鼠尿液中的小分子代谢物，阐述由DEN导致的体内代谢变化机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 Inova 600 MHz型核磁共振波谱仪(美国Varian公司)；5 mm 核磁管(美国威尔玛公司)。

1.2试药 DEN(美国Sigma公司)；2，2-二甲基-2-硅杂戊烷-5-磺酸钠(DSS)缓冲液(武汉安隆科讯公司)；超纯水，Milli-Q系统(美国Millipore公司)。

1.3动物 选择SPF级健康SD雄性大鼠，体质量180±20 g，随机分为2组，即正常对照组(n=10)与肝癌模型组(n=9)，适应性饲养3 d。实验动物由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：[SCXK (新) 2011-0004]。所有动物实验程序均符合伦理学相关规定。

2 方法

2.1动物模型的制备 正常对照组大鼠按需饮用灭菌水，肝癌模型组大鼠按需饮用质量浓度为0.1 mg·mL-1的DEN溶液造大鼠肝癌模型。连续饮用18周，每周称定1次质量，2组大鼠建模周期完成后的最后1天禁食但自由饮水，采集24 h尿样，麻醉，取肝脏，置于多聚甲醛溶液中。

2.2动物肝脏病理切片 将肝脏样本用40 g·L-1的通用型多聚甲醛固定；依次用体积分数为70%，80%和100%的乙醇梯度洗脱，二甲苯透明，组织块浸蜡和包埋，将包埋好的组织切片，HE染色，在显微镜下观察组织形态学改变。

2.3尿液核磁共振检测 将尿液样品以12 000 r·min-1离心10 min，取450 μL上清液，加入DSS缓冲液50 μL至5 mm核磁管中，采用Inova 600型核磁共振波谱仪调用NOESYPRESAT1D脉冲序列进行核磁共振氢谱的测定。水峰采用饱和时间为2 s的预饱和方式压制，参数设置为采样点数：32 k，谱宽：10 000 Hz，扫描次数：128次，测试时间：1.64 s，测试温度：25 ℃。为识别和鉴定图谱中的峰，对部分样本进行了核磁共振二维谱检测，包括质子全相关谱(Total correlation spectroscopy，TOCSY)，H-H同核相关谱(1H-1H Homonuclear correlation spectroscopy，1H-1H COSY)和J-分解谱(J-resolved spectroscopic，J-RES)等。

2.4图谱处理和统计学分析 对所有核磁共振氢谱进行相位及基线调整，并用指数窗函数进行处理，其增宽因子为0.5 Hz。DSS缓冲液作为内标，其化学位移定为0 ppm。化学位移在0～10 ppm范围内将图谱分成3 367段进行自动积分，每段为0.003 ppm；因尿液中的水信号对分析结果有干扰，因此除去δH=4.95～4.70 ppm范围的水峰信号。剩余的信号积分值进行归一化，采用SIMCA-P软件对数据进行正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)，PLS模型(偏最小二乘法)的外部验证采用200次的排列验证试验，以便判断分析模型的有效性。代谢物在2组中的差异性采用OPLS-DA分析中的VIP值来判断，将没有采用的r值删除。差异性代谢物参与的代谢通路采用MetaboAnalyst 3.0进行分析，影响因子(pathway impact)>0.1和-log(p)>3的代谢通路被认为是2组中差异明显的代谢通路。

3 结果

3.1组织病理诊断结果 大鼠肝脏组织病理诊断结果见图1。由图1可知，正常对照组大鼠肝小叶结构完整，细胞排列成索状，肝细胞胞浆红染，细胞核多位于中央，肝血窦见少量红细胞，门管区小叶间动静脉及结构完整；肝癌组大鼠肝小叶结构不完整，肝细胞排列呈巢状，血管多，部分区域见癌性坏死，癌细胞有明显异型性，大小不一。

图1 大鼠肝脏病理切片图

A.肝癌模型组；B.正常对照组。

Fig.1 Liver pathological sections of rats

A.hepatocellular carcinoma model group；B.normal control group.

3.2大鼠体质量变化 见图2。由图2可知，随着模型建立时间的延长，2组大鼠体质量差距逐步扩大，肝癌组大鼠体质量明显低于正常对照组(P<0.01)。

图2 大鼠体质量变化趋势图

Fig.2 The trend of body weight change in rats

3.3肝脏指数变化 正常对照组与肝癌模型组大鼠肝脏质量与肝脏指数变化见表1。由表1可知，与正常对照组大鼠比较，肝癌模型组大鼠的肝脏质量与肝脏指数差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 大鼠肝脏质量及肝脏指数

Tab.1 Liver weight and liver index in rats

组别n肝脏质量均值/g 肝脏指数/mg·g-1正常对照组1011.76±1.14 25.36±2.75肝癌模型组924.48±5.82# 61.34±2.62#

注：与正常对照组比较#P<0.01。

3.4尿液核磁共振检测的各项代谢物变化 核磁共振氢谱见图3。由图3A可知，采用OPLS-DA分析后，正常对照组与肝癌模型组大鼠实验参数分别为R2=0.394，Q2=0.831，说明OPLS-DA分析模型得到了较好的分离，2组间差异明显。由图3B可知，外部验证分析参数分别为R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)，表明正常对照组和肝癌模型组代谢成分有明显差异，显示PLS模式分析有效，具有预测能力。根据1H-NMR谱显示，与正常对照组比较，肝癌模型组大鼠尿液代谢物的含量变化较明显，肝癌模型组中含量明显减少的尿液代谢物有异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、醋酸盐、糖蛋白、丙酮酸盐、琥珀酸盐、α-酮戊二酸、苯丙酸盐和甲酸盐10种，而含量明显升高的代谢物有柠檬酸、二甲基亚硝酸、肌酸、牛磺酸和肌酸酐5种，见图4和表2。对含量变化明显的代谢物参与的代谢通路运用MetaboAnalyst 3.0进行分析，得出共有4种代谢通路发生了明显变化，见表3。

图3 大鼠尿液OPLS-DA分析的得分图与排列验证实验结果

A.尿液核磁共振氢谱的OPLS-DA分析的得分图；B.排列验证实验结果：R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)。

Fig.3 The score plot and arrangement test results analysis of rat urine OPLS-DA

A.score plot of OPLS-DA analysis of urine nuclear magnetic resonance spectroscopy；B.arrangement verification test results，R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221).

图4 尿液核磁共振氢谱图

a.肝癌模型组，b正常对照组；1.异亮氨酸；2.乳酸；3.丙氨酸；4.醋酸盐；5.糖蛋白；6.丙酮酸盐；7.琥珀酸盐；8.柠檬酸；9.二甲基亚硝酸；10.α-酮戊二酸；11.肌酸；12.牛磺酸；13.肌酸酐；14.苯丙氨酸；15.甲酸盐。

Fig.4 Urine nuclear magnetic resonance spectroscopy

a.hepatocellular carcinoma model group；b.normal control group；1.isoleucine；2.lactic acid；3.alanine；4.acetate；5.glycoprotein；6.pyruvate；7.succinate；8.citric acid；9.dimethyl-nitrosamine；10.α-ketoglutaric acid；11.creatine；12.taurine；13.creatinine；14.phenylalanine；15.formate.

表2 尿液中差异性代谢物及其VIP值

Tab.2 The difference of metabolites in the urine and their VIP value

代谢物化学位移归属VIP值异亮氨酸0.92(t)δ-CH32.277乳酸1.32(d),4.11(q)CH3,CH4.228丙氨酸1.47(d)CH3,CH1.597醋酸盐1.91(s)CH37.955糖蛋白2.03(s)CH31.448丙酮酸盐2.22(s)CH31.448琥珀酸盐2.40(s)CH22.724柠檬酸2.53(d)CH2,CH26.985二甲基亚硝酸2.71(s)CH33.009α-酮戊二酸3.02(t)12.666肌酸3.03(s)CH36.945牛磺酸3.25(t),3.41(t)CH2SO35.253肌酸酐4.05(s)CH21.598苯丙氨酸 7.37(m)H41.583甲酸盐8.45(s)CH1.326

注：s为单峰，d为双重峰，t为三重峰，q为四重峰，m为多重峰。

表3 差异性代谢通路分析

Tab.3 Different metabolic pathways analysis

差异性代谢通路影响因子P丁酸代谢0.041 070.001 014柠檬酸循环(TCA循环)0.147 210.001 014乙醛酸和二羧酸代谢通路0.407 410.011 763苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成0.500 000.042 158

4 结论

代谢组学通过分析体内小分子代谢物的变化，寻找与疾病相关的潜在鉴别标志物，由此在临床疾病诊断中有突出的优势，可提供早期诊断依据[12]。本研究使用DEN造模，采集大鼠尿液，并对其进行检测与分析。研究结果证明，肝癌导致大鼠尿液代谢物成分变化明显，会引起代谢通路的改变。

研究结果表明，与丁酸代谢通路相关的代谢物有丙酮酸盐和琥珀酸盐，二者在肝癌大鼠动物模型中的含量明显降低。琥珀酸半醛和丙氨酸是γ-氨基丁酸(GABA)在γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)的催化下与丙酮酸反应生成，而GABA主要是由Glu在α-位上的脱羧反应合成。琥珀酸半醛脱氢酶(Succinate semlalehyde dehydro-genase，SSADH) 氧化 SSA 形成琥珀酸进入三羧酸循环[13]。还原型辅酶Ⅰ(NADH)对以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为辅助因子的SSADH活性有抑制作用，SSADH 酶活性高低与NADH的浓度相关。琥珀酸半醛能被SSADH可逆性地催化形成琥珀酸，然而在GABA代谢旁路中关键的酶是SSADH。肝癌的发生发展过程中体内能量的变化可能是由SSADH的活性变化所致[14]。

柠檬酸循环(TCA)是许多重要物质生物合成的前提，也是多种能量代谢联系的枢纽，更是三大营养素的最终代谢通路。柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性影响TCA循环中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成，同时NADPH所提供的质子数量也能影响活性氧自由基(ROS)在体内的代谢，因此ROS的清除能力受ICDHm在TCA循环中的活性的影响。NADH与还原型黄素二核苷酸(FADH2)共同作用促使二磷酸腺苷(ADP)和Pi反应合成腺苷三磷酸(ATP)，产生ROS。TCA循环的中间产物(如草酰乙酸和α-酮戊二酸)是氨基酸和脂肪的原料。在TCA循环中，通过产物的反馈抑制实现柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的调节。肝脏细胞中的线粒体在合成ATP的同时会生成ROS，其含量共同调节着机体的细胞凋亡和基因表达等生理生化活动，二者在机体内处于动态平衡[15-16]。2个单位的乙酰辅酶A经过乙酰循环生成1分子的琥珀酸是乙醛酸循环总体反应的最主要途径，新合成的琥珀酸从乙酰酸体转移到线粒体，并在线粒体中转变为苹果酸，草酰乙酸在柠檬酸合酶的作用下生成柠檬酸[17]。二羧酸是脂肪酸进入三羧酸循环的关键步骤，是乙酰辅酶A生物合成的关键通道，限速酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。

研究结果表明，二羧酸通路中的甲酸盐在肝癌模型组大鼠尿液中的含量明显降低，进一步证明其与肝癌模型组大鼠体内能量的消耗有关。但肝癌模型组大鼠尿液中柠檬酸的含量增多，TCA循环中NAD+将α-酮戊二酸氧化并释放ATP变成琥珀酸，在柠檬酸和α-酮戊二酸的进一步氧化过程中起到关键作用的是NAD+/NADH的活性。NAD+/NADH的浓度直接影响细胞的衰老、癌变和死亡等生命过程[18-20]。

在肝脏中有大部分氨基酸分解代谢。甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸等生物合成或降解的主要通道是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路[21]。苯丙氨酸在医学、营养学等领域均有应用，是人体必需的氨基酸[22]。为了达到抑制肿瘤细胞生长的目的，需要苯丙氨酸解氨酸(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)生成反式苯丙烯酸，从而降解肿瘤细胞所需的特异性代谢前体[23]。实验结果表明，肝癌模型组大鼠模型中苯丙氨酸含量明显降低，考虑可能与HCC的发生发展有密切关联。

有学者利用核磁共振对肝硬化与肝癌患者的血清进行了代谢组学研究。结果显示，与健康人相比，肝硬化与肝癌患者血清中醋酸盐、丙酮酸盐、谷氨酰胺、甘油、酪氨酸、异亮氨酸、乙酰乙酸和肌酸等含量有显著变化，实验结果显示，在肝癌模型组大鼠尿液中醋酸盐、丙酮酸盐和异亮氨酸代谢物的含量明显降低，肌酸的含量增加。

肿瘤细胞代谢极其旺盛，癌症的发展时刻伴随着体内代谢物的变化，因此本实验运用代谢组学方法，使用化学致癌剂DEN诱导建立肝癌大鼠模型，通过肝癌模型组大鼠尿液代谢物含量的变化得出大鼠体内有4种代谢通路发生了明显变化。本实验结果可为肝癌的基础研究和早期诊断提供参考依据。