新疆不同产地石榴花中总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量测定

李建梅，李 颖，希尔艾力·吐尔逊*

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所维吾尔医方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830049；2.中国科学院大学，北京 100039)

石榴花为石榴科植物石榴PinicagranatumL.的干燥花瓣，含有多酚类、黄酮类和三萜类等多种成分[1]，在《中华人民共和国卫生部药品标准》(维吾尔药分册)中有记载[2]，具有止泻收敛和止血止汗等功效，主治腹泻日久，外用治疗出血不止、口舌生疮、脱肛痔疮、口臭牙痛和皮肤瘙痒等，还可用于治疗中耳炎和糖尿病等[3]。

我国新疆和田、喀什和阿图什等地石榴品质较好，是新疆特产[4]。石榴花资源丰富，含有丰富的活性物质，具有很高的保健及药用价值。文献报道，石榴整株植物活性物质的研究和开发多集中于石榴籽、叶和果皮，相对而言石榴花的研究内容较少，主要集中在黄酮类或多酚类物质的研究[5-10]，其资源开发也受到局限。本文采用紫外-可见分光光度法和HPLC法，首次测定了9个新疆不同产地的石榴花药材中的总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量，对其质量控制提供了数据支持，以期为开发利用石榴花资源提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489紫外检测器(美国沃特斯公司)；Cintra 20紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；SECURA124-1CN电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；RUPT-10-W超纯水机(滕州新瑞分析仪器有限公司)；DFT-200手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；PTHW调温电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)；SK8210HP超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药 没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号110831-200302)；鞣花酸对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司提供，供含量测定用，批号476-66-4)；甲醇、乙腈均为色谱纯[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]；水为超纯水；磷酸、乙酸均为分析纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；磷钼钨酸、碳酸钠和干酪素，均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂)；药材分别来自新疆和田皮山县、和田县、和田于田县、喀什叶城县、喀什疏附县和阿图什市等9个产地当年产的石榴花，并经希尔艾力·吐尔逊主任药师鉴定为石榴科植物石榴PinicagranatumL.的干燥花瓣。

2 方法与结果

2.1总鞣质的测定

2.1.1对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品12.6 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水定容至刻度，使完全溶解，精密量取5.0 mL，置于50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.050 4 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 精密称取石榴花药材粉末(过60目筛)0.4 g，置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，室温下放置24 h，超声处理10 min，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀后滤过，弃初滤液，精密量取续滤液20 mL，置于100 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得[11-15]。

2.1.3检测波长的确定 取2.1.1项下制备的对照品溶液和2.1.2项下制备的供试品溶液各2.0 mL，分别置于25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1.0 mL，再加水10 mL，以质量浓度为290 g·L-1的碳酸钠溶液定容，摇匀，室温下放置30 min，同法制备空白对照溶液，全波长扫描400～900 nm。结果对照品溶液和供试品溶液均在760 nm波长处有最大吸收，因此选择样品的检测波长为760 nm。

2.1.4样品的测定 总酚的检测：精密吸取2.1.2项下制备的供试品溶液2.0 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1.0 mL，摇匀，再加水10 mL，摇匀，用质量浓度为290 g·L-1的碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，室温下放置30 min，同时设置空白对照溶液，测定各溶液吸光度值并计算含量。

未被吸附多酚的检测：称取0.6 g干酪素，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入2.1.2项下制备的供试品溶液25 mL，密塞，30 ℃水浴中保温1 h，期间时时振摇，取出放冷至室温，摇匀，滤过，弃初滤液，精密量取续滤液2.0 mL，按照总酚检测方法中自“加入磷钼钨酸试液1.0 mL”起，制备样品，依法测定吸光度值，计算总鞣质含量，公式：总鞣质含量=总酚含量-未被吸附的多酚含量。

2.1.5方法学考察

2.1.5.1线性关系考察 精密量取2.1.1项下制备的对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分别置于6个25 mL棕色量瓶中，先分别加入磷钼钨酸试液1.0 mL，再加水定容至13 mL，以质量浓度为290 g·L-1体积分数为29%的碳酸钠溶液定容，摇匀，室温下放置30 min，同时设置空白对照溶液，依法测定吸光度值A。以对照品质量浓度为横坐标(x)、吸光度值A为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算回归方程为y1=0.100 2x1-0.003 3，r1=0.999 6(n=6)。说明没食子酸质量浓度在1.000 8～10.080 0 μg·mL-1范围内与吸光度值的线性关系良好。

2.1.5.2精密度实验 精密吸取2.1.2项下制备的供试品溶液2.0 mL，按照2.1.4项下方法测定供试品溶液的吸光度值，连续测定6次。结果6次吸光度RSD值为0.77%(n=6)，表明该仪器精密度良好。

2.1.5.3重复性实验 精密称取同一批石榴花药材粉末6份，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.4项下方法检测总酚与未被吸附的多酚，计算样品中总鞣质的含量。结果6份样品的平均总鞣质含量为49.67 mg·g-1，RSD值为2.43%(n=6)，说明该检测方法重复性良好。

2.1.5.4稳定性实验 取2.1.2项下制备的供试品溶液，在显色后的0，15，30，40，50和60 min测定吸光度值A。结果溶液在1 h内吸光度RSD值为2.86%(n=6)，表明供试品溶液在配制后1 h内稳定性良好。

2.1.5.5加样回收实验 精密称取石榴花药材粉末0.4 g，置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，室温下放置24 h后，超声处理10 min，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀后滤过，弃初滤液，精密量取续滤液5.0 mL，6份，分别置于50 mL棕色量瓶中，精密加入2.1.1项下制备的没食子酸对照品溶液8.0 mL，用水稀释至刻度，摇匀。按照2.1.4项下样品检测方法测定吸光度值，计算总鞣质含量及回收率。结果6份样品的平均回收率为99.10%，RSD值为2.00%。

2.2没食子酸和鞣花酸的含量测定

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取没食子酸与鞣花酸对照品适量，分别置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.452和0.242 mg·mL-1的没食子酸对照品储备液和鞣花酸对照品储备液。精密吸取上述没食子酸对照品储备液2.0和5.0 mL，加甲醇分别定容至25 mL量瓶中，制成质量浓度为0.036 16和0.090 4 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液；精密吸取鞣花酸对照品储备液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.024 2 mg·mL-1的鞣花酸对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 没食子酸测定样品的制备：精密称取石榴花药材粉末0.3 g，加水40 mL，回流提取45 min，定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得[16-17]。

鞣花酸测定样品的制备：精密称取石榴花药材粉末0.1 g，加甲醇40 mL，回流提取15 min，定容至50 mL量瓶中，用0.45 um微孔滤膜过滤，即得[18-19]。

2.3色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；没食子酸测定流动相：乙腈-2 mL·L-1甲酸水溶液(1∶99)；鞣花酸测定流动相：乙腈-2 mL·L-1甲酸水溶液(24∶76)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃[15-20]。色谱图见图1。

图1 HPLC 图

A.没食子酸对照品；B.没食子酸样品；C.鞣花酸对照品；D.鞣花酸样品；1.没食子酸；2.鞣花酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance of gallic acid；B.sample of gallic acid；C.reference substance of ellagic acid；D.sample of ellagic acid；1.gallic acid；2.ellagic acid.

2.4标准曲线的绘制与线性关系考察 精密吸取2.2.1项下制备的没食子酸对照品溶液2.0，5.0，8.0，11.0和14.0 μL，鞣花酸对照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0和9.0 μL，分别按照2.3项下色谱条件进样分析，以对照品峰面积为纵坐标(y)、进样量为横坐标(x)进行线性回归，得没食子酸和鞣花酸的回归方程分别为：y2=3 886 311.63x2-2 516.44(r2=0.999 9)和y3=10 545 570.25x3-46 224.00，(r3=0.999 9)。结果表明，没食子酸与鞣花酸含量分别在0.072 32～0.506 20和0.024 20～0.217 80 μg范围内，进样量与峰面积线性关系良好。

2.5精密度实验 精密吸取2.2.1项下制备的没食子酸和鞣花酸对照品溶液，按照2.3项下色谱条件注入液相色谱仪，重复进样6次，记录各自峰面积，没食子酸峰面积的RSD值为0.58%，鞣花酸峰面积的RSD值为0.53%。

2.6重复性实验 精密称取石榴花药材粉末(和田皮山县)，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.3项下色谱条件分别测定没食子酸和鞣花酸的含量，结果6份样品中没食子酸和鞣花酸的平均含量分别为2.51和3.37 mg·g-1，RSD值分别为2.06%和1.79%(n=6)。

2.7稳定性实验 精密称取石榴花药材细粉(和田皮山县)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别在相应色谱条件下于0，2，4，6，8，12和24 h进样10 μL，测定没食子酸和鞣花酸峰面积RSD值分别为1.02%和1.87%(n=6)。

2.8回收率测定 结果见表1。

2.8.1没食子酸 精密称取石榴花(和田皮山县)药材细粉6份，每份0.25 g，加入2.2.1项下制备的质量浓度为0.090 4 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液3.5 mL，置于圆底烧瓶中，加15 mL水回流提取45 min，放冷至室温，定容至25 mL量瓶中，平行制备6份供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进样测定，结果没食子酸的平均回收率为100.92%，RSD值为1.85%。

2.8.2鞣花酸 精密称取石榴花(和田皮山县)药材细粉6份，每份0.06 g，加入质量浓度为0.242 mg·mL-1的鞣花酸对照品储备液0.8 mL，置于圆底烧瓶中，加入40 mL甲醇回流提取15 min，放冷至室温，定容至50 mL，平行制备6份供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进样测定，鞣花酸的平均回收率为101.30%，RSD值为1.78%。

表1 回收率测定结果

Tab.1 Results of recovery test (n=6)

成分样品量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%没食子酸641.56316.40970.67101.98100.921.85638.04316.40980.82104.13628.00316.40938.1899.01634.78316.40953.21100.32647.83316.40961.8299.63650.59316.40969.73100.42鞣花酸176.93193.60368.9799.12101.301.78173.22193.60369.28101.42186.36193.60386.47103.49173.89193.60373.31103.35191.75193.60386.37100.53182.32193.60375.7199.89

2.9样品的含量测定 按照2.2.2项下方法分别制备没食子酸和鞣花酸含量测定用供试品溶液，分别测定总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量，结果见表2。

表2 不同产地石榴花含量测定结果

Tab.2 Determination of the contents of pomegranate flowers from different areas

产地总鞣质含量/mg·g-1没食子酸含量/mg·g-1鞣花酸含量/mg·g-1库车县62.792.395.34和田于田县85.622.633.09喀什叶城县58.373.812.37和田洛浦县45.452.633.29和田皮山县113.983.185.22和田墨玉县42.622.554.45和田县38.442.513.23喀什疏附县60.433.413.04阿图什市60.983.634.32

3 讨论

石榴花药材收载于《中华人民共和国卫生部药品标准(维吾尔药分册)》1999年版中，原标准仅有药材的显微鉴别项，未对其含量进行说明。本研究通过收集新疆不同产地的石榴花，检测其总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量，为新疆石榴花的质量控制提供理论依据。

本研究采用梯度洗脱同时测定没食子酸与鞣花酸的含量，但由于石榴花中没食子酸与鞣花酸含量差异较大，同时检测峰面积差异较大，为了尽可能减小2种成分相互间含量的误差，且2种成分的样品制备条件亦不同，故选择以不同色谱条件、分别制备样品进行检测。所得各峰的分离度与拖尾因子均符合《中国药典》2015年版要求，峰形更好、干扰较小。该方法灵敏度高、分离度好、测定迅速、结果准确，为石榴花的质量控制提供了实验依据。

本研究对新疆维吾尔自治区内不同产地石榴花进行检测发现，石榴花中总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量各有差异，和田皮山县石榴花的3种成分含量均显著高于其他产区石榴花，这一研究结果可能与新疆皮山县的 “皮亚曼石榴”的久负盛名有关。同时对于开发利用石榴花提供了一定的参考依据。若利用这部分资源开发新制剂，可增加石榴的附加值，提高经济效益。