HPLC法测定蒙药地格达-4汤中秦皮乙素的含量

万琪臻，石 翠，马桂芝

(新疆医科大学，乌鲁木齐 830011)

地格达-4汤为蒙医传统药方，是由紫花地丁、黄连、栀子和瞿麦4味蒙药组成的复方汤剂，具有清糟和归精等作用，主治血热相搏、肝胆热、咽喉肿痛和口渴烦热等症。

紫花地丁是地格达-4汤的主药，为堇菜科植物紫花地丁(ViolayedoensisMakino.)的干燥全草，收载于《中国药典》2015年版一部[1]。紫花地丁性寒，味微苦，具有清热解毒和凉血消肿的功效[2]，主要含有香豆素类、苷类和黄酮类化合物[3-6]，其中秦皮乙素具有明显的抗炎、抗菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等药理作用[7]。目前多采用TLC和HPLC法对秦皮乙素进行定性、定量分析[8-11]。

目前，地格达-4汤的质量标准仅有检查项，无法保证制剂的质量可控性以及临床用药安全性。因此，本实验采用响应面优化样品前处理工艺，用HPLC法测定秦皮乙素的含量，为地格达-4汤的质量控制及质量标准研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 π NAP cosmosil C18色谱柱(日本Nacalai Tesque公司)；岛津LC-20AD液相色谱仪，SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器(日本岛津公司)；AB135-S电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ5200DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 地格达-4汤(批号分别为：20170912，20171201,20180305和20180423)，紫花地丁(批号161012)，瞿麦(批号150716)，黄连(批号170518)和栀子(批号170518)，制剂及药材均由新疆博尔塔拉自治州蒙医医院提供。秦皮乙素对照品(批号C25J7Y18390，上海源叶生物科技有限公司)；甲醇为色谱纯(乌鲁木齐国耀化玻仪器有限公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液 精密称取秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为888.00 μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2供试品溶液 精密称取地格达-4汤(批号20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加入甲醇超声处理，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3阴性样品溶液 按照地格达-4汤的处方组成和比例，制成不含紫花地丁的阴性样品，按照2.1.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.2色谱条件 色谱柱为π NAP cosmosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为30 ℃；以甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液(21∶79)为流动相；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为345 nm；进样量为10 μL。

2.3样品前处理方法的优化

2.3.1Box-Behnken响应面法 根据前期单因素实验结果，以甲醇体积分数、液料比和超声温度为考察因素，各因素选3个水平，以秦皮乙素峰面积为评价指标，采用Box-Behnken响应面法优化供试品溶液的制备工艺(其中12个为析因实验，5个为中心实验)[12-18]。因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平

Tab.1 The factors and levels of response surface method

水平因素A,甲醇体积分数/%B,液料比C,超声温度/℃-1404∶13006012∶15018020∶170

2.3.2模型的建立和方差分析 响应面分析实验结果见表2。

采用Design Expert 8.0.6软件对表2中的实验结果进行方差和多元二次回归拟合，得到回归方程：Y=1.339×106+2.099×105A+1.123×105B+83 164.13C-1.161 2×105AB-36 234.25AC+15 798.50BC-2.087×105A2-46 658.57B2-12 760.83C2。

表2 响应面分析实验结果

Tab.2 Results of response surface analysis test (n=17)

实验编号编码值A,甲醇体积分数/%B,液料比C,超声温度/℃峰面积值10001 328 15920001 340 26330001 331 10840001 343 87950001 350 1586-10-1770 86570111 476 818801-11 295 1719-1101 161 5541010-11 281 06711-1-10603 37012-1011 025 940131011 391 205141101 241 073150-1-11 113 367160-111 231 820171-101 327 432

秦皮乙素峰面积回归方程的方差分析结果见表3。由表3可知，模型极显著(P<0.000 1)，此模型R2=0.997 9，调整R2=0.995 1，说明该模型能解释99.79%响应值的变化，失拟项P>0.05，差异不显著，即该模型与实际实验拟合较好。由等高线图及响应面图可直观了解各因素之间两两交互作用对地格达-4汤中秦皮乙素提取效果的影响，见图1至图3。比较各因素的F值可知，影响实验结果大小的顺序：A>B>C，即甲醇体积分数>液料比>超声温度。

甲醇体积分数和液料比对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面图见图1，由图1可知，固定甲醇体积分数，随着液料比的升高，峰面积值增加，但增加不明显；固定液料比，随着甲醇体积分数的增大，峰面积增加，当甲醇体积分数为60%时，峰面积值最大，随后逐渐减小，因此当甲醇体积分数为60%、液料比为20∶1的区域有最大峰面积值。甲醇体积分数和超声温度对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面图见图2。由图2可知，固定甲醇体积分数，随着超声温度的增加，峰面积值增加，70 ℃时峰面积值最大；固定超声温度，随着甲醇体积分数的增大，峰面积值增加，当甲醇体积分数为60%时，峰面积值最大，随后逐渐减小，因此当甲醇体积分数为60%、超声温度为70 ℃时有最大峰面积值。液料比和超声温度对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面图见图3。由图3可知，固定液料比，随着超声温度的增加，峰面积持续增大，70 ℃时峰面积最大，但趋势不明显；固定超声温度，随着液料比的增加，峰面积持续增大，20∶1时峰面积最大，由此可得，液料比为20∶1，超声温度为70 ℃时有最大峰面积值。

表3 秦皮乙素峰面积回归方程的方差分析结果

Tab.3 Results of regression equation analysis of aesculetin peak area

方差来源平方和自由度均方和FP显著性模型8.193×101199.103×1010361.77<0.000 1∗∗A,甲醇体积分数/%3.524×101113.524×10111 400.34<0.000 1∗∗B,液料比1.010×101111.010×1011401.28<0.000 1∗∗C,超声温度/℃5.533×101015.533×1010219.88<0.000 1∗∗AB1.039×101111.039×1011412.94<0.000 1∗∗AC5.252×10915.252×10920.870.002 6∗BC9.984×10819.984×1083.970.086 7A21.834×101111.834×1011728.68<0.000 1∗∗B29.166×10919.166×10936.430.000 5∗∗C26.856×10816.856×1082.720.142 8残差1.761×10972.516×108失拟项1.432×10934.774×1085.800.062 3纯误差3.293×10848.233×107总和8.211×101116

注：*P<0.05表示差异显著；**P<0.01表示差异极显著。

图1 甲醇体积分数和液料比对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面

Fig.1 Response surface and contour of the effects of methanol volume fraction and the liquid-to-solid ratio on extraction process of aesculetin

图2 甲醇体积分数和超声温度对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面

Fig.2 Response surface and contour of the effects of methanol volume fraction and ultrasonic temperature on extraction process of aesculetin

图3 液料比和超声温度对秦皮乙素提取工艺影响的等高线和响应面

Fig.3 Response surface and contour of the effects of liquid-to-solid ratio and ultrasonic temperature on extraction process of aesculetin

用回归模型进行预测分析，综合评分峰面积预测值为1.490 79×106，最优条件为：体积分数为60%的甲醇，液料比为20∶1，70 ℃超声提取。

2.3.3验证实验 根据Design Expert 8.0.6软件给出的最优实验条件进行实验。平行3次，实际秦皮乙素的峰面积值为1 462 666，1 449 989和1 476 818，平均峰面积值为1 463 158，与预测值之间的相对误差仅为1.89%，表明模型预测值与实验值之间有很好的拟合性，证实了响应面法可用来分析各因素对地格达-4汤中秦皮乙素提取工艺的影响。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系与范围 精密称取秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为888.00 μg·mL-1的对照品溶液，倍量稀释得质量浓度分别为444.00，222.00，111.00，55.60，27.80，13.90，6.94和3.47 μg·mL-1的系列对照品溶液，注入液相色谱仪进行分析，记录峰面积，以峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归，得回归方程：y=44 291x-171 496，r=0.999 8，表明秦皮乙素质量浓度在3.47～888.00 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.2专属性考察 分别精密吸取2.1项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，按照2.2项下色谱条件进样测定。见图4。结果表明，在选定的实验条件下，目标成分峰形对称，分离度好，阴性无干扰。

图4 HPLC图

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.秦皮乙素。

Tab.4 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample solution；C.negative sample solution；1.aesculetin.

2.4.3精密度 精密称取地格达-4汤(批号20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加体积分数为60%的甲醇20 mL，70 ℃超声(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用体积分数为60%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照2.2项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，并计算RSD值。测得秦皮乙素峰面积的RSD值为0.60%，表明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性 精密称取地格达-4汤(批号20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加体积分数为60%的甲醇20 mL，70 ℃超声(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用体积分数为60%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。将供试品溶液在室温条件下放置0，2，4，6，8，10和12 h后依次吸取10 μL。按照2.2项下色谱条件进样，记录峰面积，并计算RSD值。测得秦皮乙素峰面积的RSD值为1.66%，说明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.4.5重复性 精密称取同一批地格达-4汤(批号20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，加入体积分数为60%的甲醇20 mL，70 ℃超声(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用体积分数为60%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，平行操作6次。按照2.2项下色谱条件进样，计算秦皮乙素含量及其RSD值。RSD值为1.54%，表明该方法重复性良好。

2.4.6加样回收率 精密称取6份已知秦皮乙素含量的地格达-4汤(批号20170912)粉末1 g，置于25 mL量瓶中，分别加入一定质量的秦皮乙素对照品，加入体积分数为60%的甲醇20 mL，70 ℃超声(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用体积分数为60%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样，记录峰面积值并计算平均加样回收率及RSD值。结果平均加样回收率为96.0%，RSD值为0.93%，表明该方法准确度较好。见表4。

表4 回收率实验结果

Tab.4 Results of recovery test (n=6)

编号本底值/mg加入量/mg测得值/mg加样回收率/%平均回收率/%RSD/%10.8690.8231.65595.496.00.9320.8720.8231.67297.330.8700.8231.65595.340.8690.8231.65895.950.8680.8231.65195.160.8710.8231.67097.1

2.4.7样品的测定 精密称取4批次地格达-4汤粉末各1 g，分别置于25 mL量瓶中，加体积分数为60%的甲醇20 mL，70 ℃超声(200 W，50 kHz)20 min，放冷，用体积分数为60%的甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，各批次平行操作3次，按照2.2项下色谱条件进样，计算秦皮乙素含量，结果批号分别为20170912，20171201，20180305和20180423的地格达-4汤中的秦皮乙素含量分别为816±5.61，815±6.08，825±5.33和828±1.21 μg·g-1。

3 讨论

3.1地格达-4汤中指标成分的选择 地格达-4汤是由紫花地丁、黄连、栀子和瞿麦4味蒙药组成的复方汤剂，紫花地丁为方中主药。其中，紫花地丁主要含有香豆素类、苷类和黄酮类化合物[3-6]，秦皮乙素含量较高[19]，且具有明显的抗炎、抗菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等药理作用[7]。因此，本实验选择以秦皮乙素为指标成分，建立其定量分析方法，以控制地格达-4汤的质量，确保其在临床应用中的有效性及安全性。

3.2检测波长的选择 在200～400 nm波长范围内进行扫描，秦皮乙素在345 nm处有最大吸收峰，因此选择345 nm为检测波长。

3.3流动相的选择 实验过程考察了甲醇-1 mL·L-1磷酸[20]，乙腈-1 mL·L-1磷酸[9]为流动相，结果显示，当甲醇-1 mL·L-1磷酸比例为21∶79时，分离效果较好，分析时间适宜，因此选择甲醇-1 mL·L-1磷酸(21∶79)为流动相。

3.4供试品制备工艺的选择 本实验首先进行了单因素实验，分别考察了甲醇体积分数、液料比、超声时间、超声温度和超声功率5个因素对结果的影响，结果表明，甲醇体积分数、液料比和超声温度3个因素影响较大(最优水平为：体积分数为60%的甲醇，液料比为12∶1，70 ℃超声)，因此，将这3个因素代入响应面实验进一步确定地格达-4汤的制备工艺。对4批样品进行含量测定，秦皮乙素的含量分别为816±5.61，815±6.08，825±5.33和828±1.21 μg·g-1。

本实验建立了地格达-4汤中秦皮乙素的HPLC定量分析方法，该方法简便、准确，可有效控制地格达-4汤的质量。