荧光法快速测定水中粪大肠菌群

2019-05-15由希华李恒庆宗雪梅

中国环境监测 2019年2期

由希华，徐标，李恒庆，宗雪梅

山东省环境监测中心站，山东济南 250101

粪大肠菌群，是指一群能在(44.5±0.5)℃ 温度下生长，发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，国外又称耐热大肠菌群。主要来源于人畜粪便，可导致肠道传染病传播[1]。水源水一旦被粪便污染，就存在肠道病原菌污染引起肠道传染病甚至流行病的可能。因此，粪大肠菌群的检测可准确及时地监控水源水受粪便污染的状况，为相关部门有效预报和控制流行疾病的发生与传播提供重要依据。

目前，国内外粪大肠菌群的检测方法可分为多管发酵法、快速纸片法、滤膜法、酶底物法、荧光原位杂交(FISH) 技术、PCR 技术等[1-3]。国内粪大肠菌群监测方法主要有滤膜法、多管发酵法，并且这2种方法均属于国标方法[4]，被国内环境监测部门广泛采用。这2种方法分析成本低，结果较准确，但是操作繁琐，需专业人员严格控制无菌条件，操作时间长(至少需要48 h)，并需要验证试验，不能快速对水的卫生状况作出评价[3]，不适合应急现场监测。因此，采用更为快速、简便、精确的监测方法显得尤为重要。荧光法可以弥补传统方法的不足，无需专业技术人员和严格无菌条件，无需验证试验。荧光法操作简单，一般人员经过简单培训即可在现场完成操作，并且测定范围广，无需稀释，测定范围可达108MPN/100 mL，消除了人为带入的误差。全自动微生物监测仪可独立自动完成培养、测试、结果判读、发送报告等工作，故不受场地限制，可直接应用于现场监测。监测时间为动态时间，与待测样本中目标细菌的浓度有关，浓度越高，检测时间越短，最快可2 h内给出阳性测试报告，最长需要18 h。并可在第一时间将测试报告发送到指定邮箱，更适合应用于应急现场监测，做到早期预警，防止进一步危害的发生。

2010年，加拿大皇后大学研究人员和加拿大水质专家组成科研团队，提出使用聚合物光学传感器检测同类型微生物荧光指标的方法。该方法目前已经在全球十余个国家和地区得到广泛应用，并获得多个权威部门的认证，这些部门包括中国环境监测总站、中国疾病预防控制中心、美国环保署、AOAC协会、新西兰卫生部、菲律宾卫生部等。

1 实验部分

1.1 仪器设备及试剂

实验所用仪器和设备主要有微生物快速测定仪、培养箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、采样瓶等。

实验试剂包括：粪大肠检测试剂套筒(以下简称FCA套筒)、乳糖蛋白胨培养液、EC培养基、伊红美蓝琼脂、硫代硫酸钠溶液、无菌水等。

1.2 反应原理

将一定量的水样与培养基混合均匀放置于44.5 ℃温度下培养，粪大肠菌群在选择性培养基上产生β-半乳糖苷酶，并分解荧光底物释放出荧光产物(疏水)。荧光产物逃离水样聚合至光学检测区，通过光度计测定，依据荧光强度与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，建立数学模型，从而得出粪大肠菌群的浓度。

1.3 实验方法

打开电源开关，设置添加样品，录入样品编号，选择TECTA-FCA-FC选项，点击“ADD”，设置完成。将注入100 mL水样的FCA套筒放入指定检测池。关闭上盖，仪器开始自动检测。当仪器检测到粪大肠菌群，自动检测停止，并报告检测数据。

2 结果与讨论

2.1 准确度的测定

微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，检测所得结果全部经对数(以10为底)转换后，再进行精密度与准确度的统计分析。

采用有证标准物质美国IDEXX粪大肠菌群标准菌株(NCTC 9001)验证方法准确性，标准菌株浓度为653MPN/100 mL(65～1 350MPN/100 mL)。

将无菌水加入FCA套筒中，并定容至100 mL。将标准菌株加入套筒中，盖紧上盖，摇匀。放入微生物检测仪中检测。

在6家实验室对标准菌株进行测定，每家实验室平行测定6次，测试结果见表1。

表1 标准菌株测试结果Table 1 Standard strain testing results MPN/L

对实验室数据进行汇总统计分析，计算实验室内相对误差，以计算荧光法的准确度。结果表明：6家实验室平行测定结果均在标准菌株浓度(65～1 350MPN/100 mL)误差范围内，实验室内相对误差为-2.75%～1.71%，准确度较高。

2.2 精密度测定

实验室精密度的研究需要采集高(4.6×107MPN/L)、中(4.6×105MPN/L)、低(4.6×103MPN/L)3个不同浓度水平实际水样进行测试，在6家实验室中每家实验室平行测定6次。

将待测水样加入FCA套筒中，并定容至100 mL。盖紧上盖，摇匀，放入微生物检测仪中检测，测试结果见表2～表7。

表2 1号实验室实际水样精密度测试数据Table 2 No.1 laboratory regular water sample precision test data

注：i为实验次数，S和RSD为原始数据以10为底，对数转化后计算所得，下同。

表3 2号实验室实际水样精密度测试数据Table 3 No.2 laboratory regular water sample precision test data

表4 3号实验室实际水样精密度测试数据Table 4 No.3 laboratory regular water sample precision test data

表5 4号实验室实际水样精密度测试数据Table 5 No.4 laboratory regular water sample precision test data

表6 5号实验室实际水样精密度测试数据Table 6 No.5 laboratory regular water sample precision test data

表7 6号实验室实际水样精密度测试数据Table 7 No.6 laboratory regular water sample precision test data

对实验室的数据进行汇总统计分析，计算实验室内精密度，以实验室内和实验室间相对偏差表示[5]。监测结果表明：6家实验室内的相对标准偏差范围分别为1.30%～3.93%、1.94%～4.72%、1.88%～4.54%，实验室间的相对标准偏差分别为1.14%、1.59%、1.72%，精密度较高。

2.3 荧光法与多管发酵法相关性实验

选择不同的地表水、废水样品进行荧光法与多管发酵法比对测试[6-9]，讨论方法适用性。实验中采用38份地表水及污水水样进行粪大肠菌群的监测，多管发酵法所用培养基、试剂和测定方法参照《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行)》[4]的相关要求，荧光法操作步骤同上，荧光法和多管发酵法测粪大肠菌群的线性回归分析见图1。相关系数(r)为0.984 4，标准化系数为0.984，回归系数(B)为1.077，表明荧光法与多管发酵法结果之间有显著的线性相关关系。