五环三萜类化合物抗肿瘤活性的研究进展
2019-05-13方山丹向润清范译丹范源
方山丹 向润清 范译丹 范源
摘要:恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康最主要的疾病之一,肿瘤不仅具有极高的致死率,且肿瘤的发病率呈逐年上升趋势,发病人群也趋于年轻化,因此受到国内外医学界的高度重视。现代研究中发现五环三萜类化合物具有良好的抗肿瘤活性,也为将来开发抗肿瘤新药打下一定的基础,总结了近几年五环三萜类化合物抗肿瘤活性的研究情况。
关键词:五环三萜类化合物;抗肿瘤活性;作用机制
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:1007-2349(2019)04-0083-05
五环三萜类化合物是一类由6个异戊二稀结构单元联结而成的萜类化合物,广泛地分布于自然界,五环三萜类化合物按结构类型的不同,主要分为四大类型,分别是齐墩果烷(Oleanane)型、乌苏烷(Ursane)型、羽扇豆烷(Lupane)型和木栓烷(Friedelane)型。齐墩果烷型的代表物为齐墩果酸(oleanolic acid,OA)、山楂酸(Maslinic acid,MA)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA);乌苏烷型的代表物为熊果酸(Ursolic acid,UA)、科罗索酸(Corosolic acid,CRA)和积雪草酸(Asiatic acid,AIA);羽扇豆烷型的代表物为桦木酸(betulinic acid,BA)、2,3-羟基桦木酸(23-hydroxyl betulinic acid);木栓烷型的代表物为雷公藤红素和扁蒴藤素。本文对近几年四类五环三萜化合物抗肿瘤的研究分别进行介绍。其具有丰富的生物活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、护肝、抗心律失常调节血糖和降血压等方面的药理作用[1]。近年来的研究发现五环三萜类化合物能对多种肿瘤具有较好的抑制作用,且毒副作用较小,因此也逐渐成为科研关注的的热点。本文就五环三萜类化合物的结构类型、抗肿瘤活性作一综述。
1 乌苏烷型五环三萜化合物抗肿瘤活性
熊果酸(Ursolic acid,UA)在自然界中分布很广,存在于杜鹃花科植物雄果的叶、果实,唇形科植物夏枯草的果穗、茎,茜草科植物栀子的果实等多种不同科、属植物中。Shan 等[2]应用10,20 和 40μmol/L剂量的UA 处理直肠癌 HT-29 细胞株时,流式细胞仪检测结果显示UA可呈时间和剂量依赖性地诱导直肠癌 HT-29 细胞凋亡;western blot结果显示:给予UA后,Bcl-2 和 Bcl-xL 表达均显著性降低,且caspase-3,caspase-9的表达也显著增加。实验结果表明 UA 能促进直肠癌 HT-29 细胞发生凋亡,其作用机制可能是通过下调 Bcl-2和Bcl-xL表达,其作用机制可能是通过激活caspase-3,caspase-9,从而抑制直肠癌 HT-29 细胞增殖,诱导其凋亡。Ye Zhang等[3]研究发现,20 μmol/L 的UA和0.4μmol/L 的奥沙利铂的联合用药对人结肠癌细胞HCT-8 和SW480的抑制率分别为67.22%和72.07%,强于单用20 μmol/L 的UA对这两种细胞的抑制率,分别是45.6%和45.05%,同时强于单用0.4μmol/L 的奥沙利铂对这两种细胞的抑制率分别是51.18%和45.2%,提示UA可能有增强奥沙利铂抑制人结肠癌细胞HCT-8 和SW480增殖的作用。流式细胞术检测结果表明UA和奥沙利铂联合用药后,也能增强奥沙利铂诱导人结肠癌细胞HCT-8 和SW480凋亡的能力。用western blot 法检测ROS因子的表达,发现人结肠癌细胞HCT-8 和SW480在给予UA和奥沙利铂处理后,生产ROS资源的 NADPH蛋白表达显著增加,同时也增加了ROS 表达水平。相关研究表明,ROS因子能激活 JNK信号通路来促进凋亡,提示UA可能是通过增加ROS因子表达水平来增强奥沙利铂的诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力。张维文等[4]研究发现,用不同浓度的UA处理人乳腺癌细胞株 MCF-7,MTT法结果显示UA对人乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用呈浓度依赖性;流式细胞仪结果显示UA可诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡,且呈浓度依赖性,同时细胞不同周期的比例也发生变化,在 50μm ol/L时,G0-G1占了 90%;用免疫荧光法检测发现p53在人乳腺癌细胞株MCF-7中的表达增多,提示对UA诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的主要机制可能是上调p53 的表达来实现的。华杰等[5]研究发现,采用不同浓度的 UA 干预人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1,MTT 法结果显示UA对 TPC-1 细胞增殖的抑制呈现出浓度和时间的依赖性;流式细胞仪结果显示 UA 可诱导 TPC-1 细胞凋亡呈浓度依赖性,且将 TPC-1 细胞的生长阻滞在S期;QRT-PCR 和Western blot 实验均显示 UA可能通过下调抗凋亡因子Bcl-2和上调促凋亡因子Bax和Caspase-9 来发挥其诱导甲状腺乳头状癌细胞TPC-1凋亡的作用;陈锡强等[6]研究发现,与模型组相比,UA能明显地抑制接种肝癌细胞SMMC-7721的斑马鱼节间血管生长,提示UA也可通过抑制血管生成来发挥其抗肿瘤作用。
科罗索酸(Corosolic acid,CRA)又称2α-羟基熊果酸,是一种天然存在的熊果酸衍生物。其来源于千屈菜科植物大花紫薇的提取物,常以游离形式或皂苷的形式存在于大叶紫薇、枇杷和山楂等植物中。Kyoung Jin Nho等[7]研究发现,Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示 CRA呈浓度依赖性诱导肺癌细胞 A549 细胞凋亡;用Western blot法检测 bcl-xl 和 survivin 的蛋白表达情况,结果表明bcl-xl 和 survivin 的蛋白表达均减少,提示CRA可能通过下调抗凋亡因子bcl-xl 和 survivin 来诱导肺癌细胞 A549 细胞凋亡。欧阳慧等研究[8]发现,用不同浓度CRA处理人非小细胞肺癌SPC-A-1细胞,MTT法结果显示科罗索酸能够抑制SPC-A-1人非小细胞肺癌的生长增殖,其IC50=1.05×10-6mol/L;吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)染色法测定结果显示CRA能够呈剂量依赖性地诱导人非小细胞肺癌細胞SPC-A-1的凋亡。Qi-Lai Cheng等[9]从猕猴桃中分离得到CRA,用MTT法检测发现:CRA能够呈浓度和时间依赖性地抑制胃癌细胞BGC823的增殖;RT-PCR结果显示 CRA能够显著减少抗凋亡因子p65,bcl-2 mRNA的表达;Western blot结果显示CRA能减少抗凋亡蛋白 p65,p-IkBa,bcl-2的表达;电泳迁移率变动分析法(EMSA)和免疫荧光染色法结果显示CRA能够抑制核转录因子NF-κB,p65的易位与衰减,并呈剂量依赖性地显著降低NF-κB的DNA结合活性,进而抑制NF-κB的活性,推测CRA可能通过下调NF-κB通路来诱导胃癌细胞BGC823凋亡。Hyun Su Lee等[10]研究发现,CRA与5-FU联合用药对人胃癌细胞SNU-620的抑制作用强于单用5-FU或单用CRA,且在CRA与5-FU联合用药浓度为CRA(100 μM)+5-FU(75 μg/mL)时,其抗人胃癌细胞SNU-620 增殖的作用达到最强;V-FITC/PI双染法结果表明用CRA与5-FU联合用药处理人胃癌细胞SNU-620后,能够显著增加人胃癌细胞SNU-620的晚凋比例;western blot 法检测凋亡标志物Bcl-2,Bim,caspase-3的表达,实验结果表明,与单用5-FU处理人胃癌细胞SNU-620相比,在CRA与5-FU的联合作用下,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低,促凋亡蛋白Bim的表达显著增加,同时还激活了caspase-3因子,提示CRA能够通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bim的表达进而激活caspase-3凋亡通路来增强5-FU诱导人胃癌细胞SNU-620的凋亡的作用。
积雪草酸(Asiatic acid,AIA)又名亚细亚酸,是伞形科植物积雪草 Centella asiatica(L.)Urban 中提取的三萜酸,AIA也是积雪草中含量较高的乌苏烷型五环三萜酸。AIA可以诱导人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡,其 IC50为(80±1.6)μmol/L[11]。AIA对人胃癌细胞MK-1、人宫颈癌细胞 HeLa、鼠黑色素瘤细胞B16F10 均具有显著的抑制增殖作用[12]。吕婷婷等研究[13-14]发现,用MTT法检测AIA对多发性骨髓瘤细胞RPM I 8226细胞增殖的影响,结果显示AIA能呈浓度及时间依赖性地抑制多发性骨髓瘤细胞株RPM I 8226细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染法检测显示,随着AIA浓度的增大,多发性骨髓瘤细胞RPM I 8226 细胞发生凋亡,主要表现为早期凋亡率的增加;RT-PCR结果显示随着AIA浓度的增加,抗凋亡因子survivin 和 bcl-2的 mRNA表达也下降,呈剂量依赖性。相关研究表明,AIA可通过降低 bcl-2和bcl-xl的表达,从而调节bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡蛋白的比率,激活Caspase-9凋亡通路来发挥其诱导细胞凋亡的作用。
2 齐墩果烷型五环三萜化合物抗肿瘤活性
齐墩果烷型五环三萜化合物在许多植物中的含量较高,其中以齐墩果酸(Oleanoic acid,OA)的含量最丰富,OA同时也是熊果酸的同分异构体。有研究表明OA可以抑制人神经胶质瘤细胞U-87 MG的生存、生长,血管生长以及迁移和侵袭[15]。因OA具有对肝癌细胞HepG2细胞毒作用,从而能抑制HepG2细胞的生长[16]。魏鉴腾[17]用MTT 法检测 OA 对胰腺癌 Panc-28 细胞的影响,发现OA 能明显抑制胰腺癌Panc-28细胞的增殖,并且随着浓度的不断升高,细胞的存活率会逐渐下降,呈现浓度依赖性关系,其IC50为46.35 μg mL-1。且当浓度大于50 μg mL-1时,OA对胰腺癌 Panc-28 细胞的抑制率要高于5-FU。吴林蔚等[18]研究发现,OA 对卵巢癌细胞株IGROV1 和人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 两种细胞地的增殖均有很好的抑制作用。有研究显示OA能通过激活P53参与的前凋亡通路和抑制NF-κB通路来诱导黑色素瘤 B16F-10 细胞凋亡[19]。
山楂酸(Maslinic acid,MA)是一种天然的齐墩果烷型五环三萜类化合物,同时也是齐墩果酸的一种衍生物,主要存在于橄榄的果实和叶子中。科研工作者对MA的抗肿瘤活性进行了许多的研究,早在1989 年,Numata A[20]发现了MA对白血病 P-38 肿瘤细胞具有细胞毒性,其抑制活性 ED50=13.0 μg/mL。在之后的研究中发现,MA对白血病支系多重耐药性细胞CEM/ADR5000的IC50为9.0μM,其表明多重耐药性细胞并未影响到MA对肿瘤细胞的抗性[21]。研究表明,MA可以抑制 NF-κB 的激活以及调控下游相关基因来发挥其诱导细胞凋亡的作用[22]。MA还能降低 NF-κB 的基因表达水平,包括癌细胞分化(Cyclin D1、COX-2 和 c-Myc)、凋亡(Survivin、Bcl-2、Bcl-xl和XIAP)、侵袭(MMP-9 和 ICAM-1)以及血管内皮生长(VEGF)相关的基因。也有研究发现MA及MA的一些衍生物(包括OA)都可以诱导黑色素瘤 B16F-10 细胞凋亡[23]。
甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)是中药甘草中主要有效成分之一,是一种齐墩果烷型五環三萜化合物。因为GA有着广泛的抗肿瘤作用,且对正常的体细胞毒性较小,所以GA在抗肿瘤方面的研究也得到国内外医学研究者的关注。Yoshiko 等[24]报道甘草次酸诱导人肝癌 HepG2 细胞凋亡,呈现剂量依赖性,激活 caspase 8,下调抗凋亡蛋白 bcl-2和bcl-xl,同时促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 的表达未受影响,可推测GA能通过选择性调控抗凋亡蛋白的表达来诱导癌细胞凋亡。18β-甘草次酸是GA的代谢产物,黄炜等[25]研究表明,18β-甘草次酸能呈剂量依赖性抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,同时也具有诱导其凋亡的作用,该实验也考察了 Ca2+螯合剂对18-甘草次酸MCF-7细胞凋亡的作用的影响,实验结果显示Ca2+螯合剂能够抑制18-甘草次酸诱导MCF-7细胞凋亡的作用,提示18-甘草次酸发挥其诱导MCF-7细胞凋亡的作用和Ca2+有着密切的联系。姚俊杰等[26]研究发现GA对胃癌SGC7901细胞的增殖的调控具有双向性,当GA浓度低于100μmol/L时,能显著抑制胃癌SGC7901细胞的增殖。当GA浓度超过100μmol/L,抑制细胞增殖的能力减弱。GA对SGC7901细胞的抑凋亡蛋白Bcl-2的抗凋亡作用也具有双向性,浓度低于17%的IC50时增强,高于17%的IC50时又出现显著的减弱。Jin Chen等[27]研究发现,用不同浓度的GA处理肝癌细胞HCC,用Counting Kit-8(CCK-8)法测定GA在体内和体外抑制肝癌细胞HCC的增殖活性,CCK-8法结果显示GA在体外能呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞HCC的增殖,在体内实验中GA也能抑制肝癌细胞HCC移植瘤的生长;流式细胞术结果表明GA能呈剂量依赖性地诱导肝癌细胞HCC凋亡,并阻滞肝癌细胞HCC在G0/G1期;用Western Blot法检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成,并发现GA可能通过抑制自噬和蛋白IRE1α的表达来增强其抗肿瘤的效果。研究表明,GA能够抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、侵袭和迁移,并且与BLM解旋酶的低表达有关,而GA促进PC3细胞发生凋亡与细胞凋亡因子Caspase-3高表达有关[28]。
3 羽扇豆烷型五环三萜类化合物抗肿瘤活性
白桦脂酸(Betulinic acid,BA)又称桦木酸,其在白桦树皮中的含量最为丰富,BA也是通过生物活性引导分离得到的第一种羽扇烷型三萜类化合物。因BA在抗HIV和抗黑色素瘤方面有突出的作用,且毒性较低而开始受到人们广泛的关注,许多体外实验表明,BA对黑色素瘤细胞有很强的选择性细胞毒性,并且在携带人类黑色素瘤的无胸腺小鼠进行的后续研究中,肿瘤生长被完全抑制而没有毒性[29],由此也可预见BA在治疗黑色素瘤方面有着良好的开发前景。随着科研工作者对BA研究的深入,近年来发现,BA除了有较好的抗黑色素瘤作用以外,还拥有广谱的抗肿瘤作用[30-33]。柏玉冰等[31]从夏枯草中分离得到了BA,并在随后的MTT实验中发现BA能够选择性地显著抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-321细胞增殖,且对正常乳腺细胞MCF-10A抑制不明显,反映BA能选择性地抑制肿瘤细胞。关瑞宇等[32]研究发现:不同浓度的BA作用于人结肠癌 HT-29细胞,MTT法实验结果表明BA可以在体外水平呈浓度和时间依赖性地的抑制人结肠癌 HT-29 细胞的增殖;流式细胞仪结果显示BA可以诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡,并呈剂量依赖性;细胞划痕实验结果显示BA能降低HT-29细胞的迁移能力;实时荧光定量PCR检测乙酰肝素酶的表达,发现BA可减少人结肠癌HT-29 细胞内乙酰肝素酶的表达,提示BA可抑制人结肠癌HT-29 细胞内乙酰肝素酶的表达来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。也有研究表明,BA可显著抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖,其机制可能是通过上调caspase-3、Cyto C蛋白的表达诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡[33]。还有研究发现BA可以呈剂量性和时间性地抑制人肾癌细胞的增殖,并且可能通过线粒体介导的凋亡途径诱导人肾癌细胞凋亡,同时抑制其迁移和侵袭[34]。从这些研究中都可发现BA能通从多种途径发挥其抗肿瘤作用。
BA的一种天然的衍生物2,3-羟基桦木酸(23-hydroxyl betulinic acid)也存在广大植物中,其也有良好的抗肿瘤活性。叶银英等[35]研究发现在体外实验中2,3-羟基桦木酸对体外黑色素瘤 B16 细胞有明显的抑制作用,同时在体内实验中发现2,3-羟基桦木酸能能通过将黑色素瘤 B16 细胞阻滞在 G0 ~ G1 期从而促使移植瘤小鼠的肿瘤体积减小。有研究表明,10~160 mg·L-1剂量的2,3-羟基桦木酸对人胃癌 SGC-7901 细胞系、人卵巢癌 A0 细胞系等6种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,并且呈现一定的剂量依赖性。该研究也发现2,3-羟基桦木酸能够通过阻滞肿瘤细胞周期来达到诱导肿瘤细胞凋亡的目的[36]。相关研究表明,2,3-羟基桦木酸有明显抑制 HepA 实体瘤的作用,且低、中、高剂量组抑瘤率均在30 %以上[37]。
4 木栓烷型五环三萜类化合物抗肿瘤活性
从雷公藤中分离纯化的南蛇藤素,也叫雷公藤红素,是一种木栓烷型的五环三萜化合物。王晓南等[38]发现,MTT实验结果表明雷公藤红素能呈浓度依赖和时间依赖性抑制人白血病细胞U937细胞增殖;Annexin V-FITC/PI结果显示雷公藤红素能呈浓度依赖性方式诱导U937细胞凋亡;流式细胞术实验结果表明雷公藤红素能将细胞生长期阻滞在G0/G1期,提示雷公藤红素可能通过将细胞阻滞于G0/G1期来诱导人白血病细胞U937细胞的凋亡。王晓南等[39]在后续的研究发现,雷公藤红素能显著地抑制K562细胞增殖,其IC50是(2.15±0.11)μmol/L;并呈剂量依赖性方式来诱导白血病K562细胞发生凋亡。徐佳等[40]研究中发现,用浓度为 0.5、1.0μmol/L 的雷公藤红素作用食管癌ECA-109 细胞24 h,MTT 法结果显示雷公藤红素對 ECA-109 细胞粘附的影响,且其可呈剂量依赖地减弱食管癌ECA-109细胞的粘附能力;划痕实验结果显示雷公藤红素能呈时间和剂量依赖性抑制食管癌ECA-109 细胞的迁移;Transwell 实验结果表明,雷公藤红素呈浓度型地抑制食管癌ECA-109 细胞的侵袭,PCR 和 Western blot实验结果显示雷公藤红素对Wnt信号通路中相关蛋白β-Catenin、LRP6的表达也有显著的抑制作用,提示雷公藤红素可能通过下调Wnt信号通路来发挥其对食管癌 ECA-109 细胞的调控作用。
从卫矛科植物南蛇藤中分离的扁蒴藤素是一种天然存在的木栓烷型五环三萜类化合物,徐美珍等[42]报道,在体外实验中,扁蒴藤素对白血病 P388 细胞有很强的抑制作用。闺娥等[43]研究中发现,扁蒴藤素能够通过抵抗药乳腺癌细胞 MCF-7/TAX的对紫衫醇产生的耐药性来发挥其对乳腺癌细胞 MCF-7/TAX的抑制作用。Ju-Hyung等[44]研究发现,扁蒴藤素能够通过调节AKT/FOXO3a通路来诱导结肠癌细胞凋亡。李暐等[45]研究发现,用不同的浓度作用于人鼻咽癌HNE2 细胞,MTT结果显示扁蒴藤素对人鼻咽癌HNE2 细胞的增殖有显著的抑制作用;流式细胞术和western blot实验结果表明扁蒴藤素可诱导人鼻咽癌HNE2凋亡,此外,扁蒴藤素能上调 Bim 等前促凋亡蛋白的表达,减少Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表达,提示扁蒴藤素可能通过上调 Bim蛋白的表达,减少Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表达进而诱导人鼻咽癌HNE2发生凋亡。
5 小结
综上所述,五环三萜类化合物不仅能从诱导细胞凋亡、抑制细胞的增殖、迁移、阻滞细胞周期、抗血管生成等多种途径中发挥其抗肿瘤作用,且毒性较低,这类化合物在未来开发抗肿瘤药物中蕴藏着巨大的潜力。但大多数五环三萜类化合物目前还存在着不溶于水,且生物利用度较低的局限性,导致该类化合物在利用和开发受到了很大的限制,将来对五环三萜类的开发利用还需要考虑怎样提高其生物利用度,此外在对五环三萜类研究中也发现该类化合物不仅本身具有抗肿瘤作用外,还能增强其他抗癌药物抗肿瘤作用,其具体的作用机制尚待进一步研究发现,这同时也为更合理地开发利用五环三萜类化合物的抗肿瘤作用提供了一个新的思路。
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