新疆裸重唇鱼和斑重唇鱼遗传多样性分析

赵雪飞 ，米博翰 ，梁利群 ，马勇强 ，孙博 ，常玉梅

（1.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨150040；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；4.新疆新源县普禄科生态农业有限公司，新疆 新源830000）

新疆裸重唇鱼Gymnodiptychus dybowskii和斑重唇鱼Diptychus maculates同属裂腹鱼亚科Schizothoracinae，同为特化等级的裂腹鱼类[1]。前者属裸重唇鱼属Gymnodiptychus，又称裸黄瓜鱼，分布于我国伊犁河流域和准噶尔盆地等水域，为新疆维吾尔族自治区I级水生野生保护动物；后者属重唇鱼属Diptychus，又称斑黄瓜鱼，分布于新疆塔里木河水系伊犁河流域，为新疆维吾尔族自治区II级水生野生保护动物[2～4]。

21世纪初由于人类生产活动和利益驱使，新疆裸重唇鱼和斑重唇鱼等一些珍稀鱼类遭过渡捕捞，资源遭到严重破坏[5]。为了保护这两种鱼类资源，在伊犁河流域上多座水利水电工程建设中开展了相应的人工救护和增殖放流工作[6]，并对已建水电站进行水生生物及环境监测，控制外来物种入侵,严格按照相关法规进行增殖放流，保护新疆土著鱼类[7]。目前对这两个物种的研究多集中于野外调查和种群进化等研究[8～11]，对其种内遗传多态性的研究尚未见报道。

新疆裸重唇鱼和斑重唇鱼体表均裸露几乎无磷，野外群体空间分布具有较高的重叠性和相似性，当地人统称两种鱼类为棒子鱼[12]，针对两物种的分子遗传学研究未见报道。本研究在已发表的文献中选用与两种鱼为同亚科的其他鱼类的微卫星标记共51对，分别对两个物种的群体DNA样本进行PCR扩增，分析两物种种群的种内多态性与种间遗传距离，同时筛选出可用于这两个物种种质鉴定的分子标记，以期为两个物种的种群保护提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年12月，在新疆新源县普绿科生态农业有限公司，分别采集来自巩乃斯河上游恰普河的斑重唇鱼（BCC）、新疆裸重唇鱼（LCC）各 15尾，剪取部分腹鳍组织，置于95%乙醇中保存。

1.2 方法

1.2.1 微卫星引物

本研究所用的51对引物分别来自郝卓然、段鹏翔及杨天燕等已发表的文献[13～15]，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。同时对两物种中随机选取的3个样本，进行PCR扩增稳定性及多态性进行检测，选择适宜的微卫星标记共16个，检测全部30个样本的多态性（表1）。

1.2.2 PCR扩增

采用标准酚-氯仿法，提取鳍条样品的DNA，用Thermo Nano Drop 8000分光光度计测量浓度，稀释样本浓度至10ng/μL备用。

PCR 扩增体系为 25μL，包括 2×mix 12.5μL，上下游引物各（10mmol/L）1μL，基因组 DNA 2μL，灭菌ddH2O补齐。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性 45s，退火 45s，72℃延伸 1min，35 个循环；最后再72℃延伸10min，4℃保温，退火温度依引物而定（表1）。扩增反应在ABI Veriti96梯度PCR仪上完成。取1μLPCR扩增产物于8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(140 V，3.5～4h)，银染显色后拍照记录，分子量标准为DL2000。

1.2.3 数据分析

用Gel-Pro Analyzer 4.5软件分析电泳条带大小。经电泳获得的基因指纹图谱在引物扩增的片段大小范围内，将有正确扩增条带的标记用作分析各物种种群的种内多态性，只有单一物种出现扩增条带的标记可用作两物种的种质鉴定。

用Pop Gene32软件统计微卫星标记的等位基因数（Allele Number，N）、有效等位基因数（Effective number of allele，Ne）、观测杂合度（Observed heterozygosity，H）以及期望杂合度（Expected oheterozygosity，He）。采用Pop Gene32软件进行χ2检验估计群体的Hardy-Weinberg平衡偏离，同时统计并计算了Nei氏遗传距离、遗传相似系数（Genetic similarity index，I）、基因流（Nm）、群体间近交系数（FST）和多态信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）等遗传参数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果与分析

51个微卫星标记对BCC和LCC两个群体的30尾样本进行PCR扩增，筛选出可用标记为16对。其中可用于BCC种内多态性分析的标记共13个（HLJ3919、HLJ2228、BW014、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45、TLM10、HLJ2433、HLJ2510和 HLJ2376），标记 HLJ3481和HLJ2147均只有一条带，标记BWY05带型较杂，可用于两物种的种质鉴定，不能用于BCC的种内多态性分析；可用于LCC种内多态性分析的标记为4个（HLJ3919、HLJ2229、HLJ2147 和 HLJ2217），除用于种质鉴定的标记不能被扩增出条带外，LCC在其他标记均为单一条带，无多态性；可用作两物种种质鉴定的标记为 HLJ3481、HLJ2433、HLJ2510、HLJ2376和BWY05等5个标记，这5个标记均只能扩增物种BCC。全部标记扩增出稳定而清晰片段的长度内103～534bp，部分标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图1。

表1 微卫星引物序列及扩增情况Tab.1 The sequences and am plification condition ofm icrosatellitemarkers

2.2 两个物种的遗传参数分析

用Popgen32软件计算统计了斑重唇鱼和新疆裸重唇鱼两物种的多个遗传参数（表2）。结果发现：两群体平均等位基因数（N）分别为2.375和1.75，平均有效等位基因数（Ne）分别为1.879和1.504，平均观测杂合度（Ho）分别为0.454和0.367，平均期望杂合度（He）分别为0.397和0.245。将每个标记的等位基因数与有效等位基因数；观测杂合度与期望杂合度进行成对样本的T检验。结果显示：BCC和LCC的等位基因数与有效等位基因数差异显著（P＜0.05），而观测杂合度与期望杂合度差异则为BCC显著（P＜0.05），LCC不显著（P=0.128）。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，仅LCC群体在标记HLJ2147极显著偏离平衡，表现为杂合子过剩。

图1 部分标记的电泳图谱Fig.1 Partial labeled electrophoretic maps

表2两个物种在14个标记上的遗传多样性参数Tab.2 Genetic diversity parameters of the two species at 16m icrosatellitemarkers

斑重唇鱼的多态信息含量（PIC）范围在0.180～0.616之间，新疆裸重唇鱼的多态信息含量（PIC）范围在0.124～0.740之间，根据Botstein等[16]对标记多态水平的划分标准，BCC和LCC分别有3个和1个标记为低度多态（0＜PIC≤0.25），各占整体的23.1%和25%；各有6个和1个标记为中度多态（0.25≤PIC＜0.5），占整体的46.2%和25%；各有4个和2个标记为高度多态（PIC≥0.5），各占整体的30.7%和50%。BCC和LCC的平均多态信息含量分别为0.433和0.461，虽然新疆裸重唇鱼的平均PIC要高于斑重唇鱼，但前者的可用微卫星标记较少，与斑重唇相比，新疆裸重唇鱼在多个微卫星标记均无多态性。因此，整体来看，斑重唇鱼种群的多态水平要高于新疆裸重唇鱼。

2.3 两个物种的遗传分化分析

选取共11个标记用作斑重唇鱼和新疆裸重唇鱼的遗传分化分析（HLJ3919、HLJ2228、BW 014、HLJ2147、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45和TLM10）。得到两物种的群体间近交系数（FST）平均值为0.357，表明35.7%的遗传差异来自群体间，基因流（Nm）平均值为0.451，遗传相似系数（I）平均值为0.782。两物种之间的遗传距离为0.520。利用UPGMA法构建的群体遗传关系聚类图显示，两个种群分别聚为一支，表面两个种群间不存在杂交现象（表3）。

表3 群体间遗传距离与遗传相似度Tab.3 Nei's genetic distance(above diagonal line)and genetic identity(below diagonal line)

3 讨论

2003至2007 年，马燕武等[17]曾全面调查了新疆塔里木河水系土著鱼类的种类和分布,发现塔里木河水系土著鱼类的大尺度、大空间格局上分布均有缩小趋势，仅在开都河水系发现有新疆裸重唇鱼分布，范围较以往狭窄。蔡林钢等[7]也于2012—2014年连续3年调查了新疆伊犁河上、中和下游不同河段的鱼类资源，发现伊犁河上游河段鱼类种类稀少，大中型鱼类资源更为稀少，优势种多以体型较小的冷水性土著鱼类为主，鱼类多样性较低，群落已受到干扰。可见斑重唇鱼和新疆裸重唇鱼的天然种群生存状况并不乐观。本研究对两种群种内多态性的研究结果与野外调查结果相符，新疆裸重唇鱼虽然在4个微卫星标记显示种内多态性相对高于斑重唇鱼，但在斑重唇鱼的13个微卫星标记中，有10个标记均只能扩增出单一条带，遗传背景相对单一，可见，新疆裸重唇鱼种内多态性要低于斑重唇鱼，应加强对其野外资源的保护力度。而斑重唇鱼的种内多态性分析结果虽然相对高于新疆裸重唇鱼，但对伊犁河上游河段调查发现的小型化和低龄化等情况仍不容忽视。因此对于这两种曾较广泛分布于新疆的鱼类，其野外种群数量和遗传多样性的保护工作仍需继续加强。

本研究通过筛选用于评估新疆裸重唇鱼和斑重唇鱼种内多态性评估的微卫星标记共14个，发现可用于两物种种质鉴定的微卫星标记5个，并分别分析了两物种的种内多态性等,发现新疆裸重唇鱼在多个标记均不具有多态性，遗传背景较单一，而斑重唇鱼的种内多态性虽然相对较高，但其野外种群的生存状况并不乐观。针对新疆裸重唇鱼和斑重唇鱼的野外种群保护虽然已采取了一定的措施，但尚有许多工作还需进一步开展。