我国虹鳟传染性造血器官坏死病防控研究现状

冯剑 ，赵景壮 ，刘淼 ，卢彤岩 ，纪锋 ，徐黎明

（1.本溪艾格莫林实业有限公司，辽宁 本溪 117000；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

1 我国虹鳟养殖业现状

虹鳟Oncorhynchus mykiss是鲑科鱼类的典型代表和我国主要养殖冷水鱼之一。我国虹鳟养殖主要集中在东北、西北及西南等经济欠发达地区，在提供优质安全蛋白源、促进水产养殖业结构调整和提质增效、促进山区渔民脱贫致富中发挥了不可或缺的作用。自20世纪90代中期我国虹鳟养殖规模迅速扩大，养殖产量不断提高，开始进入产业快速发展期。但从2006年开始，我国大多数虹鳟养殖区的幼鱼大规模死亡，死亡率达70%～90%，严重时可近100%[1]，导致我国虹鳟产量急剧下降，国内消费大部分依赖于进口，严重制约了产业的发展。检测发现，虹鳟幼鱼多死于传染性造血器官坏死病（Infectious hematopoietic necrosis，IHN）。

IHN是由弹状病毒——传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）引起的鱼类急性、全身性传染病，被国际兽医局（Organisation mondiale de la santé animale，OIE）列为必须申报的动物疫病，是我国水生动物二类疫病[2]。由于缺少商品化的IHN疫苗，发病虹鳟鱼苗的存活率仅为20%～30%。全球每年因IHN暴发造成的经济损失巨大，该病严重制约了虹鳟养殖业的健康发展。

2 IHN流行现状

IHN是全球性鲑科鱼常见的急性病毒性传染病，分布广泛、发病率高，对世界鲑养殖业造成了巨大的经济损失。IHN最早于20世纪50年代暴发于美国俄勒冈州和华盛顿州，70年代先后传入日本、法国和意大利，80年代末传入我国，90年代传入韩国、德国、瑞士等国家[3]。目前IHNV已传播至几乎所有的鲑鳟养殖国家。全世界的IHNV分为U、M、L、E和J型5种基因型，其中U型主要流行于美国北部西海岸和日本，M型流行于美国和俄罗斯，L型流行于美国，E型流行于欧洲大陆等国家，J型流行于亚洲等国家。中国IHNV毒株主要为J基因型（图1）。

图1 世界范围内IHNV分离株的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of global IHNV isolates

据可追溯的最早资料显示，我国于1985年首次暴发IHN[4]，在20世纪90年代有零星报道，但从2006年开始IHN在全国范围内暴发，导致虹鳟苗种大量死亡[5]。黑龙江水产研究所鱼类病害防治课题组连年在黑龙江省、吉林、辽宁省、山东省、甘肃省、青海、四川、云南、新疆等多个省的虹鳟养殖场开展流行病学调查，截止到2017年12月，以省份计算IHN检出率为100%，以养殖场计算为72.7%，说明IHN几乎流行于我国所有虹鳟养殖区（图2）。

IHN在水温7～16℃内均可出现高死亡率，一些水温适宜的养殖场四季均可发病。该病主要感染虹鳟苗种，发病后一周内即可达70%～90%的死亡率。2013年后我国陆续发现成鱼亦可感染此病，但表现为长期慢性死亡，病程可长达数月，累计死亡率＞80%；病鱼均伴随着严重的继发肠道感染症状[6]。

图2 我国养殖虹鳟及IHNV的分布Fig.2 The distribution of rainbow trout farm s and IHNV in China

3 IHN防控现状

欧美一些冷水鱼养殖大国，如加拿大、美国和挪威等先后研发了多种形式的IHNV疫苗，包括灭活疫苗[7]、弱毒苗[8]和DNA疫苗[3,9-11]等。在长期研究基础上，发现DNA疫苗具有免疫保护效果好、免疫力持久、制备简单、安全等优势，国外相关研究日益聚焦于IHN的DNA疫苗。国际上首个IHN核酸疫苗Apex-IHN已于2005年在加拿大批准上市[12]，这是目前唯一一个用于预防IHN的商品化疫苗。美国、加拿大等国家已应用该疫苗有效控制IHN的大规模暴发。由于核酸疫苗的使用，近年国外少有IHN流行暴发的报道，大力促进了冷水鱼养殖业的发展。

鉴于IHN对我国冷水鱼产业的危害，我国开展了相关防控技术的研究。中国水产科学研究院黑龙江水产研究所筛选出我国现行IHN流行株，以pcDNA 3.1真核表达载体为基本骨架进行表达载体的改造优化，构建出应用于鱼体免疫的高效表达载体；根据IHNV基因组测序结果设计引物扩增IHNV糖蛋白基因，连接至表达载体中构建出了IHN核酸疫苗pIHNch-G（图3）。体内体外鉴定结果表明，该疫苗能够在虹鳟细胞内高效表达IHNV抗原蛋白。通过系统性研究，制定了该疫苗的最佳免疫规程：采用背鳍基部肌肉注射，免疫剂量为2μg/尾（5～120g虹鳟），一次免疫即可，60度日即可产生免疫保护。免疫效果综合分析结果表明，构建的核酸疫苗能够刺激虹鳟Mx、IFN、STAT及IRF等相关免疫因子的上调表达，表达高峰为4～7d；同时刺激炎症相关因子IL-8、IL-1β及TNF-α的上升表达；免疫鱼血清IHNV中和抗体效价最高达160以上。多批次的试验结果表明，该IHNV核酸疫苗保护率可达90%以上[3]，可有效控制IHN的暴发，已成功构建出具有明显保护作用的核酸疫苗。课题组还确定了IHN核酸疫苗大规模发酵工艺参数，完成了该疫苗的临床前研究。并且对该疫苗的体内动态分布及抗性基因对环境细菌的影响开展了长期监测工作，结果证明p IHNch-G对免疫动物及环境均是安全的[13,14]。该疫苗已于2017年6月获得农业部转基因生物安全管理办公室批准，在黑龙江省开展疫苗的中间试验。目前已完成了中间试验，并提交了环境释放申报材料。黑龙江水产研究所在单价IHN核酸疫苗的基础上开展了抗IHN和传染性胰脏坏死病（infectious pancreatic necrosis,IPN）的二联核酸疫苗（p IHN/IPN-Ch）的研究。效力分析结果显示p IHN/IPN-Ch不但能够抵挡IHNV强毒株的攻击，为免疫虹鳟提供90%以上的相对保护率，而且能够显著降低虹鳟体内IPNV病毒载量[15]。该疫苗的构建有望通过一次免疫，即可实现有效防控目前我国虹鳟两种主要病毒病的目标。此外，赵景壮等[16]尝试利用酵母展示技术结合蛋白额外锚定策略，提高了展示于酵母表面的IHNV的糖蛋白数量，初步构建了口服抗IHN酵母疫苗，效力分析结果显示该疫苗能够为口服免疫虹鳟提供近50%的相对保护率。我国一些科研机构也开展了IHNV组织浆灭活疫苗的研制，亦可不同程度提高虹鳟鱼种的成活率[17]。

图3 IHN核酸疫苗p IHNch-G基因图谱Fig.3 Genemap of p IHNch-G in IHN nucleic acid vaccine

图4 二联核酸疫苗p IHN/IPN-Ch基因图谱Fig.4 Genemap of two linked nucleic acid vaccine p IHN/IPN-Ch

一些研究学者开展了抗病毒药物研究剂筛选工作。任广明等[18]开展了抗IHNV多糖的筛选工作，获得了良好的体外抗IHNV的多糖；代静等构建了转IHNV糖蛋白基因的莱茵衣藻，口服免疫小鼠后进行攻毒试验，结果显示转G基因莱茵衣藻能够刺激小鼠的T淋巴细胞的增[19]；曹永生等利用大肠杆菌表达了虹鳟IFN-γ2，攻毒试验结果显示，免疫后1d进行IHNV攻击时，鱼死亡率为40%，而免疫后2d进行IHNV攻击时，鱼死亡率达到80%[20]；王会英等在细胞水平上开展了IHNV微型基因组表达干扰素对病毒细胞内复制的抑制作用研究[21]；王宏磊等从虹鳟肠道内分离了抗IHNV益生菌一株，为IHNV活载体疫苗候选载体提供参考[22]。

此外，由于我国现阶段无商品化IHN疫苗使用，相关部门根据我国虹鳟养殖现状，制定了3个月鱼龄内的鱼苗管控措施，希望通过消灭传染源、切断传播途径，保证孵化期鱼种的成活率，亦取得了一定的防控效果[23,24]。

4 我国虹鳟IHN防控存在的问题及展望

4.1 疫苗产业化进程缓慢

疫苗是公认的最高效环保的防控病毒性病害的手段，但在我国现行疫苗审批制度下，疫苗研究成果走出实验室，走向养殖场的时间较长。实验室的成果不能及时应用于产业，阻碍了产业的发展。美国等国家的做法是，在规定的苗种养殖场可使用自行研制的疫苗，苗种场可出售经免疫的鱼苗（种）。我国当前可否借鉴此经验，允许在可控水域内充分证明了疫苗的有效及安全性前提下小规模应用疫苗，以控制该病的流行和暴发。

4.2 加强重要病害的监测

我国虹鳟产业面临着养殖规模不断扩大、养殖方式多样、苗种来源愈加复杂等现状，病原的传播途径也更加多样，给虹鳟病毒病的防控提出了新的挑战。应加强对养殖虹鳟开展多种疫病的监测工作，及时掌握疫病流行情况，为病害暴发提供预警作用。

4.3 制定综合防控方案

疫病的防控是系统工程，除特异性疫苗免疫外，切断病原的传播途径也非常重要，如引进及外销的鱼苗、鱼种进行常规的疫病监测、养殖鱼的定期疫病监测、养殖场所及养殖工具的定期消毒、投喂提高免疫力的中药及生物制剂等，只有多渠道防控才可能有效控制病害的传播。

4.4 加快水生动物无规定疫病苗种场的建设

水生动物无规定疫病苗种场的建设是从根本上解决病原传播及病害流行的关键因素之一。针对我国虹鳟养殖的特点，建立一批无IHNV鲑鳟鱼苗种场，有效控制流通的受精卵、饲料、苗种、兽药等环节，最大限度地控制病原的传染源头，有效遏制病害的大规模传播和流行。目前我国已在青海开展了无IHNV鲑鳟鱼苗种场的试点工作，应在总结经验的基础上加快在我国虹鳟主要养殖地区开展无规定疫病苗种场的建设。

综上所述，IHN是目前制约我国虹鳟产业发展的主要因素之一。历史的经验告诉我们，高效安全疫苗的使用是解决该疫病流行的最有效方式。此外，还需加强养殖过程及苗种流通的综合管理，推动并建立以免疫防治为核心的虹鳟健康养殖新模式。