间充质干细胞移植干预2-OA/BSA诱导的原发性胆汁性胆管炎小鼠肝内胆管上皮细胞自噬蛋白表达的变化*

朱赟，姚根宏，唐小军

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种慢性进展性胆汁淤积性自身免疫性肝病，特异性损伤肝内胆管上皮细胞（intrahepatic biliary epithelial cells，IBECs）。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植干预自身免疫性疾病是一项新技术。现认为MSCs可下调转录激活因子3信号通路（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）并促进细胞自噬。本实验采用2-辛炔酸结合牛血清白蛋白（2-octynoic acid-bovine serum albumin，2-OA-BSA）注射诱导PBC模型小鼠，观察了MSCs移植对IBECs蛋白表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 30只C57BL/6小鼠购自苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司【SCXK（苏）2014-0007】，6～8 周龄，体质量为（18.5±0.9）g。胎牛血清（FBS）、培养基（DMEM/F12）、胰蛋白酶/EDTA溶液（购于Invitrogen公司），抗-DLAT/丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex-E2，PDC-E2） 抗体试剂盒（Lifespan Biosciences），抗微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗体、抗自噬蛋白 Belclin-1 抗体、PVDF膜、ECL 显色液（Merck&Millipore），抗核孔蛋白 62（nucleoporin，p62）抗体、抗双链 RNA依赖性蛋白激酶R（double-stranded RNA-dependent protein kinase R，PKR） 抗体（Arigo）、pPKR（Santa Cruz）、抗角蛋白19抗体（cytokeratin 19，CK19）、抗肝细胞核因子 4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF-4α，Abcam），抗 STAT3、抗 pSTAT3 抗体、抗真核始动因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）/peIF2α抗体、抗溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein，LAMP-1）抗体、抗磷酸酶抑制剂Cocktail、抗LC3II、LC3I抗体（Cell Signaling Technology），反转录酶试剂盒、PCR扩增试剂盒（大连 Takara）。CO2培养箱（美国Sheldon公司），倒置显微镜和免疫荧光显微镜（Olympus公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 PBC模型制备与干预 取小鼠，随机分为实验组（n=18）、对照组（n=6）和未处理组（n=6）。在无菌条件下，在18只实验组小鼠，取2-OA-BSA（100 μg/25 μl，北京瀚谱生物公司）加入等量CFA（Chondrex公司），腹腔注射，之后每2周腹腔内注射2-OA-BSA+IFA。在对照组小鼠，腹腔注射BSA+CFA。22周后，随机取模型小鼠2只、对照组小鼠和未处理组小鼠各1只，观察造模情况。然后，将PBC模型小鼠随机分为以下处理组：模型组（PBC组，n=4）、MSCs移植干预组（1×106脐带间充质干细胞，n=6）和 STAT3抑制剂干预组（n=6），取 Stattic（R&D 公司）25 mg，加入 2.5%DMSO100 ml，每只小鼠腹腔注射Stattic 150 μl。两周后，处死所有小鼠，留取血清。

1.3 小鼠肝内胆管树分离 剪开腹腔，暴露肝脏，将静脉留置针插入门静脉，离断下腔静脉。用含5 mmol/L EGTA、10 mml/L HEPES和 5 μg/L 庆大霉素的Hank's液灌流2 min，清除肝内血液；用含有0.05%B型胶原酶、0.005%胰蛋白酶抑制剂、氯化钙、HEPES和庆大霉素的 Hank's液灌流 5～10 min；切下胆囊，取出肝脏，去掉肝脏表面包膜。将肝脏继续放至上述消化液中消化10 min。之后，刷除肝实质细胞，获得胆管树。

1.4 血清检验 使用全自动化学分析仪（迈瑞公司）检测血生化指标、亮氨酸肽酶、腺苷脱氨酶和球蛋白；采用ELISA法检测血清PDC-E2水平。

1.5 肝组织病理学检查和免疫组化检测 取肝组织和胆管树组织，以10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成3 μm薄片，HE染色。在胆管树组织，采用免疫组化法检测CKl9和HNF-4α 表达，加3%H2O2孵育10 min，加一抗，4℃过夜，加二抗工作液，PBS冲洗 3次，加入DAB显色。

1.6 胆管组织 LC3、p62、STAT3/pSTAT3表达的检测 采用免疫印迹法检测，取胆管组织，经研磨后，提取蛋白，每个样本分为 A、B、C，3 等分（各约 1 ml）。A份：经10%SDS-PAGE凝胶电泳，用Bio-Rad蛋白转移装置夹板，转膜90 min，将膜分别包被在一抗溶液中，4℃孵育过夜，充分洗涤。将膜从封闭液中取出，放入杂交袋中，加入稀释好的二抗，按1：1比例混合A液与B液，配置显影剂，将PVDF膜的平板置于Syngene G：BOX凝胶成像系统，曝光拍照。以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）作为内参照，检测LC3II/LC3I时，参照为β肌动蛋白（β-actin)。

1.7 肝组织LC3、p62、STAT3/pSTAT3 mRNA检测 采用PCR法，取B份蛋白样品，用Trizol试剂盒提取肝组织总RNA，测定RNA浓度及纯度。引物序列如下：LC3 musF：5'-GCGCTTGCAGCTCAATGCTA-3'，LC3 musR：5'-GTACACTTCGGAGATGGGAGTGG-3'；p62musF：5'-GAAGCTGCCCTATACCCACATCTC-3'，p62musR：5'-TGCTTCGAATACTGGATCGTGTC-3'；STAT3musF：5'-TGCACCTGATCACCTTCGAGAC-3'，STAT3 musR：5'-CCCAAGCATTTGGCATC TGAC-3'。GAPDH musF：5'-TGGCCTTCCGTGTTC CTAC-3'，GAPDH musR:5'-GAGTTGCTGTTGAAGT CGCA-3'。每份标本各蛋白做3个复孔，以SDS 2.0软件分析其Ct值。计算各标本平均Ct值，以GAPDH Ct值作为内参, 采用 2-ΔΔCt计算各组基因水平。

1.8 超微结构观察 取C样本，用PBS清洗3次，每次10 min，用1%～2%锇酸固定，乙醇脱水，环氧丙烷或丙酮置换；丙酮、包埋剂浸渍、包埋，铀染色、铅染色，于透射电镜（JEM 1010,日本电子公司JEOL）下观察。

2 结果

2.1 IBEC超微结构的变化 在BSA组，IBEC内自噬泡和自噬溶酶体（红色箭头）较模型组增多（图1），而在MSCs组和Stattic组，自噬泡、自噬溶酶体与模型组相似（图片未显示）。

图1 各组IBEC超微结构表现 箭头所指为自噬泡或自噬溶酶体

2.2 各组小鼠胆管树纯化情况 CK19主要表达于IBECs细胞质，为棕褐色颗粒分布，可见含CK19的IBECs占分离胆管组织的大部分（图2 A、B），未着色的基质、结缔组织细胞破坏、零散分布，HNF-4α特异性表达于肝细胞（图2C），HNF-4α染色的肝细胞较少（箭头所示），提示所分离的胆管树含肝细胞较少。

2.3 各组IBECs自噬相关蛋白表达情况 各组小鼠IBECs内LAMP-1阴性，模型组小鼠IBECs自噬蛋白Beclin-1、STAT3和pSTAT3表达较BSA组增强，而MSCs移植和Stattic干预组上述蛋白表达减弱（图 3）。

图2 小鼠胆管树CK19和HNF-4α表达

图3 各组IBECs自噬相关蛋白表达水平比较

2.4 各组IBECs自噬相关基因mRNA水平比较本实验未检测到PKR和LAMP-1 mRNA，模型组和MSCs组p62 mRNA水平较BSA组下降，模型组STAT3 mRNA水平较BSA组下降。

3 讨论

目前，已建立了多种与人类PBC临床和病理学特征类似的动物模型，包括NOD.c3c4小鼠、转化生长因子β受体II显性缺失小鼠模型（dnTGF-βRII）、IL-2Rα（CD25）-/-小鼠模型和Scurfy小鼠，而各自有其不足[1-3]。有人将2-OA与BSA偶联后腹腔注射诱导C57B/L小鼠发生模拟人PBC发病特征的胆管损害，为我们提供了较好的研究模型[4]。PBC主要的靶损害组织为IBECs。

2-OA是人工化合物，多见于去垢剂、化妆品和食品添加剂中[5，6]。本研究在造模22周，肝组织病理学检查发现小胆管破坏、汇管区炎性细胞浸润和肉芽肿形成，符合实验预期。

PBC模型小鼠IBECs内STAT3和pSTAT3表达增强，而MSCs移植和Stattic干预组STAT3和pSTAT3表达均有所减弱，甚至与BSA组表达类似。编码STAT3的基因位于人染色体17q21.31上，主要存在于细胞质，应激等因素可以导致线粒体STAT3的聚集[7-10]。胞质STAT3在受到外界刺激发生磷酸化和二聚体化后转移至细胞核，调控多种靶基因的表达，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。在生物体十几种STAT家族成员中，哺乳动物主要有STAT1-4、STAT5a、STAT5b、STAT6 等主要基因型[11，12]。STATs既是信号传导子,又是转录因子，目前认为STAT3与肝脏的关系最为密切[13，14]。

研究发现STAT3能通过其SH2结构域与eIF2α竞争性结合PKR，阻断自噬的发生[15-17]。本研究在IBECs未能检测出PKR，但PBC组pPKR表达较BSA组明显增强，可能与模型组诱导激活IBECs自噬有关。

本研究发现Beclin-1表达可能与细胞损害或诱导自噬有关。我们同时检测了与自噬关系密切的LC3、p62、STAT3 mRNA水平，发现它们与蛋白表达结果相反，即在蛋白表达增强的模型组，这些基因mRNA水平却较其他组降低，如模型组p62 mRNA和STAT3 mRNA水平较BSA组明显降低，可能原因为：1，高水平的蛋白表达能抑制其mRNA的转录、翻译，即翻译水平的调控可导致蛋白表达与mRNA水平不成比例；2，mRNA/蛋白稳定性差，易降解，或是蛋白经修饰、折叠后，难以测出；3，mRNA水平变化到蛋白表达的变化可能存在时间延迟，因此蛋白调控是多层次、多时空和多类型进行的。