1，25（OH）2D3通过调节 miR－146a水平抑制大鼠肝纤维化的体内和体外观察*

周丽云，李校天，李丽，杨俊超

肝星状细胞（HSC）的活化在肝纤维化的形成过程中起着重要作用[1-4]。miRNAs是一类长度约18～25 nt的调控转录后基因表达的非编码RNA，广泛存在于真核生物，也包括单细胞生物体内，参与细胞的分化、增殖和凋亡[5]。1，25（OH）2D3是维生素 D在体内的最终代谢形式，是维持机体钙和骨盐平衡的重要成分，在免疫调节、抗氧化、抗炎症反应等方面发挥着重要作用。本研究检测了CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织miR-146a水平，并在体外检测了转染miR-146a模拟剂/抑制剂并经TGF-β1诱导活化的HSC的增殖和活化情况，以进一步探讨1，25（OH）2D3抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 48只SD大鼠【河北医科大学动物实验中心（合格证编号:1602111）】，体质量为（200±20）g，随机分为对照组、CCl4模型组、橄榄油组和1，25（OH）2D3干预组，每组12只。给予大鼠50%CCl4（上海麦克林生物科技有限公司）3 ml·kg-1皮下注射，2次/w，连续8 w，建立肝纤维化模型，在对照组，给予等量的橄榄油溶媒皮下注射。自造模之日开始，在干预组，分别给予橄榄油溶媒或1，25（OH）2D3溶液（美国Peprotech 公司）3 ml·kg-1灌胃，1次/d。在实验第8 w，实验动物禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏取血，4℃ 12000 r/m离心5 min，分离血清。打开腹腔，取肝组织，4%多聚甲醛固定，用于石蜡包埋制作病理学切片，采用Metavir法行肝纤维化分期评估。另取部分肝组织用液氮快速冷冻，置于-80℃冰箱保存，以备提取miR-146a。

1.2 细胞培养 取HSC细胞（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心），用1640培养液加10%小牛血清（FBS，美国Invitrogen公司）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，培养于37℃含5%CO2培养箱中，每24～48 h换液。待细胞长满至T25培养瓶中约80%～90%时，胰酶消化传代。当传至3～4代时，使用10 pmmol/l TGF-β1（美国Sigma公司）作用细胞24 h，将细胞分为：①TGF-β1刺激组：用含10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；②转染miR-146a模拟剂组：用50 nM miR-146a模拟剂（广州锐博生物科技有限公司）/10 pmmol/L TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；③转染miR-146a模拟剂对照组（广州锐博生物科技有限公司）：用50 nM miR-146a模拟剂/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；④转染miR-146a抑制剂组：用100 nM miR146a抑制剂（广州锐博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；⑤转染miR-146a抑制剂对照组：用100 nM miR146a抑制剂对照物（广州锐博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；⑥1，25（OH）2D3干预组：用 2.5×10-6mmol/l 1，25（OH）2D3/0.1%DMSO 溶剂/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞；⑦DMSO组：以 0.1%DMSO溶剂/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培养基培养细胞。根据我们前期工作基础，设置药物浓度及培养时间，每组设5个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。

1.3 肝组织miR-146a水平检测 采用qPCR法。采用U6大鼠miR-146a源引物为内参照，采用SYBR Green I实时定量PCR法检测miR-146a相对水平，miR-146a引物为：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGG TT-3’，下游引物为 5’-ATCTACTCTCCAGGTCCTCA-3’；内参基因 U6small nuclear RNA（snRNA）的上游引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 转染miR-146a模拟剂和miR-146a抑制剂 瞬时离心miR-146a模拟剂、miR-146a模拟剂对照物、miR-146a抑制剂和miR-146a抑制剂对照物。用灭菌ddH2O配制成20 μM储存液，分装保存，用 1×riboFECTTMCP Buffer 30 μl分别稀释 20 μM miR-146a模拟剂、miR-146a模拟剂对照物、miR-146a抑制剂和miR-146a抑制剂对照物1.25 μl，轻轻混匀，加入riboFECTTM CP Reagent 3 μl，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15 min。弃掉24孔板中的培养液，加入新的无血清培养基，将CP混合液加入到新的培养基中，轻轻混匀。将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24 h。

1.5 细胞增殖检测 采用CCK8法，将HSC-T6细胞接种于96孔板，体积100 μl，每组做3个复孔，待细胞长至80%时，按照上述分组进行干预。干预24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，培养箱内孵育1 h左右，测定450 nm吸光度。细胞增殖率=（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）×100%。

1.6 细胞凋亡检测 使用流式细胞术检测，取对数生长的细胞，按上述分组干预24 h，倒去培养液，胰酶消化，用培养液轻轻吹打，4℃ 1200 r/m离心5 min，弃上清，PBS洗2次，用Binding Buffer 500 μl重悬细胞，细胞数为5×105。用孔径为40～50 μm的300目尼龙网过滤细胞，加入AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育5 min，上机进行细胞凋亡检测。

1.7 统计学方法 应用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间显著性差异分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SD大鼠血清ALT和AST水平比较 经1，25（OH）2D3处理，动物血清 AST 和 ALT 水平显著低于模型组（P＜0.05，表1），说明 1，25（OH）2D3具有保护大鼠肝功能，减轻肝损伤的作用。

表1 各组大鼠血清ALT和AST水平（±s）比较

表1 各组大鼠血清ALT和AST水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与橄榄油组比，②P＜0.05

ALT（U/L） AST（U/L）对照组 10 29.3±6.0 20.3±9.0模型组 10 353.3±128.6① 423.3±263.9①1，25（OH）2D3 11 86.7±12.6①② 56.7±15.3①②橄榄油组 12 376.7±150.4 416.7±255.4只

2.2 各组肝组织病理学表现 Masson染色结果显示，经 1，25（OH）2D3灌胃干预后，SD 大鼠肝组织可见正常的肝小叶结构，炎性浸润情况较橄榄油灌胃组明显减轻，汇管区纤维条索较橄榄油灌胃组明显变细，说明1，25-OH）2D3具有抑制大鼠肝组织炎症反应作用。

2.3 各组大鼠肝组织miR-146a水平变化 经1，25（OH）2D3灌胃干预组大鼠肝组织miR-146a水平较橄榄油处理组明显上调（P＜0.05）。

2.4 各组细胞转染miR-146a情况 结果显示转染miR-146a模拟剂组细胞miR-146a相对水平较转染miR-146a模拟剂对照物组显著增高，转染miR-146a抑制剂组miR-146a相对水平较转染miR-146a抑制剂对照物组显著降低，差异均具有统计学意义，提示转染成功。1，25（OH）2D3干预 HSC中miR-146a水平较 DMSO组明显增加（P＜0.05），提示 1，25（OH）2D3可上调细胞 miR-146a水平。

2.5 各组细胞增殖率比较 分别以2.5×10-6mmol/L 1，25（OH）2D3和 DMSO 处理细胞，以只含有 1640 培养基组为空白对照，处理 24 h 后，1，25（OH）2D3组细胞增殖率为58.8%，较DMSO组下降了15.9%；转染miR-146a模拟剂组细胞增殖率为46.5%，较转染miR-146a模拟剂对照组下降了53.3%；转染miR-146a抑制剂组HSC增殖率为132.8%，较转染miR-146a抑制剂对照物组升高了约32.8%，提示1,25（OH）2D3可抑制由TGF-β1刺激的HSC增殖。

2.6 各组细胞凋亡情况比较 1,25（OH）2D3干预细胞凋亡率为12.6%，比DMSO组细胞凋亡率提高了5.1%，与对照组比，细胞凋亡率增加了6.3%；转染miR-146a模拟剂组细胞凋亡率为16.8%，与转染miR-146a模拟剂对照物组比，细胞凋亡率增加了8.2%；与对照组比，转染miR-146a模拟剂组细胞凋亡率增加了10.4%；转染miR-146a抑制剂组细胞凋亡率为6.3%，与转染miR-146a抑制剂对照物组比减少了 2.2%，提示 1，25（OH）2D3可促进由 TGF-β1刺激的HSC细胞凋亡（图1）。

图1 各组HSC凋亡情况

3 讨论

近年研究表明，miRNA参与肝纤维化的发生和发展过程，有望成为肝纤维化诊断及干预的靶点[8]。miR-146a是miRNA家族的一员，位于人类5号染色体LOC285628基因的第二外显子上。2006年，Baltimore团队首先报道了miR-146a可通过NF-κB信号通路抑制机体的免疫反应[9]。随后，不断有研究报告指出其与机体自身免疫、炎症、病毒感染等有着错综复杂的关系。研究发现miR-146a水平的异常与病毒复制、肝细胞再生、炎症反应，甚至肝细胞癌的发生发展有密切的联系[10-14]。

1，25（OH）2D3与各种肝脏疾病的发生、发展有关，在免疫调节、抗炎、抗氧化、抗纤维化等方面均有不同程度的作用。研究发现，1，25（OH）2D3可通过降低miR-27b水平从而抑制肺纤维化进程[15]，还可通过调节miRNA表达，诱导皮肤鳞癌细胞凋亡[16]。国内亦有用它来干预硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化的报道[17]。我们采用10pmmol/L TGF-β1诱导HSC活化，再转染miR-146a模拟剂或miR-146a抑制剂。结果发现1，25（OH）2D3干预HSC细胞增殖较对照组明显降低，而转染miR-146a模拟剂组HSC增殖较对照组明显降低，转染miR-146a抑制剂组HSC细胞增殖较对照组明显增强，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。实验还发现 1，25（OH）2D3干预的HSC较对照组凋亡明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），转染 miR-146a模拟剂组 HSC 凋亡较对照组明显增加，转染miR-146a抑制剂组HSC较对照组凋亡减少，上述差异均具有统计学意义（P＜0.05），这些结果提示活化的 HSC细胞miR-146a较静息状态下下降，1，25（OH）2D3具有抑制肝纤维化的作用，其机制可能与上调HSC中miR-146a水平有关。

本研究结果显示，1，25（OH）2D3在体内体外均具有抑制肝纤维化形成的作用，并且可能通过上调HSC细胞内miR-146a水平而实现的，但其具体的信号通路还需要进一步的研究。我们将在后续的体内和体外实验中继续探索1，25（OH）2D3抗肝纤维化的作用机制及其miR-146a或其下游通路的作用，以期为1，25（OH）2D3用于抗肝纤维化的干预提供更多的理论和实验依据，也为逆转肝纤维化提供更多的药物干预思路，从而阻断肝纤维化的进展。