MiR-148a-3p通过靶向SRPK2抑制结肠癌细胞转移

王小东，马博昭，戚峰

（天津医科大学总医院普通外科，天津300052）

随着生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率每年都在增加[1]。肿瘤转移是CRC患者丧失手术机会的最重要原因之一。大约20%～25%的患者在初次诊断CRC时出现肝转移，40%～50%的患者在切除原发性CRC后发生肝转移[2]。尽管目前CRC的诊断和治疗方法取得了显著进展，肿瘤转移仍是影响结肠癌患者生存的重要因素[3]。目前，术后化疗是Ⅲ期结肠癌患者的标准治疗[4]。因此，寻找和开发结肠癌中的靶向治疗剂具有重要的意义。

MicroRNA （miRNA/miR）代表一组独特的非编码RNA分子，其通过与信使RNA（message RNA，mRNA）的3′-UTR区结合而转录后调节基因表达，导致翻译抑制或mRNA降解[5]。越来越多的证据表明，miRNA失调与许多人类疾病有关，并且与各种肿瘤的增殖和转移密切相关，包括CRC[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]和胃癌[9]。很多研究已经证明，CRC中有很多miRNA 的变化。例如，miR-135a、miR-137、miR-143、miR-148a-3p和 miR-31[10-12]。MiR-135a可以通过影响p21和周期蛋白D2影响结肠癌细胞的增殖[13]。MiR-143过表达可以抑制结肠癌增殖，促进结肠癌细胞凋亡[14]。已经有研究显示，miR-148a-3p在早期复发II期和Ⅲ期结直肠癌根治术后具有重要的临床意义。MiR-148a-3p的失调发生在多种肿瘤中，如胰腺癌[15]、胃癌[16-18]、非小细胞肺癌[19]、乳腺癌[20]和鼻咽癌[21]等。MiR-148a-3p通过抑制DNA甲基化酶Ⅰ的表达抑制胃癌的转移和侵袭[18]。MiR-148a-3p可以通过引导DNA甲基化从而调节乳腺癌表面雌激素受体的表达[20]。但是目前，miR-148a-3p对结肠癌的作用研究还很少，发挥作用的机制也不完全清楚。

富含丝氨酸/精氨酸蛋白特异性激酶（Serine/Arginine-rich protein specific kinases，SRPK），如SRPK1和SRPK2，可以磷酸化可变剪接因子/剪接因子2并调节细胞周期[22]。对于SRPK2，其发挥的主要作用是促进肿瘤细胞的转移[23]。但是目前SRPK2在结肠癌中的表达的调控机制还不完全清楚。

在本研究中，笔者发现相对于正常结直肠粘膜上皮细胞，miR-148a-3p在结肠癌细胞中表达降低，SRPK2在结肠癌细胞中表达增高。在结肠癌细胞中过表达miR-148a-3p可以抑制结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。相反的，miR-148a-3p inhibitor可以增强结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。同时，miR-148a-3p可以影响结肠癌细胞上皮-间质转化。荧光素酶报告系统结果显示，SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶点。MiR-148a-3p过表达可以抑制SRPK2 mRNA和蛋白的表达，而miR-148a-3p敲低时，SRPK2 mRNA及蛋白表达增高。MiR-148a-3p通过调控SRPK2表达可能是影响结肠癌细胞转移的机制之一。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人结肠癌细胞系（SW480，S

W620，LOVO和HCT-116）和人正常结直肠上皮细胞系FHC从中国科学院（中国上海）购买或本实验室冻存。用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在37℃，含有5%CO2的培养箱中培养细胞。培养基每2 d更换1次。

1.2 细胞转染 转染前，将2.5×104个细胞接种到6孔板的每个孔中并孵育24 h，然后弃去培养基。用100 nmol/L miR-148a mimic（Ribobio，广州，中国）或200 nmol/L miR-148a inhibitor（Ribobio，广州，中国）及对应的阴性对照（negtive control，NC）转染细胞。使用Lipofectamine 2000试剂促进转染（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。

1.3 划痕和transwell侵袭实验 通过划痕和带有Matrigel（BD Bioscience，USA）基质胶的transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力。对于划痕实验，将转染后的细胞接种于6孔板中，当细胞达到90%汇合时，吸出培养基并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两遍。在含有1%FBS的培养基中饥饿培养过夜后吸出培养基。用200 μL移液管尖端在单层细胞表面划出三条平行的划痕，用PBS洗涤细胞以除去碎片，并培养24 h观察划痕距离。对于transwell侵袭实验，将200 μL含有1×105个细胞的无血清培养基加入上室中，并将600 μL含有10%胎牛血清（FBS）的培养基加入到下室中。在37℃培养24 h后，除去基质胶，将穿透基质胶并到达基底膜的细胞在4%多聚甲醛中固定，用0.1%结晶紫染色10 min，并在倒置显微镜下计数细胞数。

1.4 荧光素酶报告系统 将结合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突变型（Mut）SRPK2序列克隆到pGL3 Basic载体（Promega）中。将293T细胞接种在24孔板中48 h后，将10 μg pLUC-Wt-SRPK2或pLUC-Mut-SRPK2与miR-148a-3p mimic或inhibitor（Ribobio，广州，中国）共转染到 293T 细胞中。培养箱中培养24 h，裂解细胞并检测荧光素酶活性（Promega，USA）。

1.5 RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR） 通过RNA提取试剂盒（QIAGEN，上海，中国）提取总RNA，并将1 μg总RNA添加至20 μL的反应系统中。GoScript Reverse Transcription试剂盒（Promega，USA）用于HOTAIR的逆转录，miR-148a-5p通过茎环法逆转录（QIAGEN，Shanghai，China）。 GAPDH和U6作为内参。引物序列如下：

miR-148a-3p，上游，5′-GCTAGCCTCCGAAGCAAACAATGAAA-3′，下游，5′-AAGCTTCGTCTACAAGGACTAACCGAAA-3′；

SRPK2，上游，5′-AGCTGGGATTATAGGCGCAT-3′，下游，5′-TTGTTAGGGGAGGGAGCTTG-3′；

Vimentin， 上 游 ，5′-CATTGAGATTGCCACCTAC-3′，下游，5′-CGTTGATAACCTGTCCATC-3′；

E-cadherin，上游，5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游，5′-GAGGATGGTGTAAGCGATGG-3′；

N-cadherin，上游，5′-ATGAAAGACCCATCCAC G-3′,下游,5′-CCTGCTCACCACCACTA-3′；

GAPDH：上游，5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；

U6：上游，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反应进行40个循环，并使用2-ΔΔCt方法计算RNA相对表达。

1.6 蛋白质印迹分析（Western blot） 使用RIPA裂解液裂解CRC细胞以获得总蛋白。每个样本40μg总蛋白分别加入10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）的样本孔中进行凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore，USA）上。用0.5%牛血清白蛋白封闭具有印迹蛋白的膜2h，然后用抗E-cadherin抗体（1∶1500，Cell Signaling Technology（CST），USA），抗 N-cadherin 抗体（1：1 500，CST，USA），抗 Vimentin 抗体（1∶1 500，CST，USA），抗 SRPK2 抗体 （1∶1 500，R&D Systems，USA） 或抗-β-actin 抗体（1∶3 000，CST，USA），4℃过夜孵育。洗涤膜3次并在室温下用稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶2 500，CST，USA）孵育2 h。使用化学发光检测试剂盒（Millipore，USA）检测免疫反应性蛋白质条带。通过G-Box系统（Syngene，USA）获得图像并通过Image J软件（美国国立心理健康研究所，USA）进行分析。

1.7 统计学分析 使用t检验或单因素方差分析（ANOVA）分析连续数据。所有数据均使用Statistic Package for Social Science软件（SPSS 19.0，USA）和GrapPad Prism（GraphPad Software，Version 5.0，USA）进行统计学分析。所有数据以±s表示，P＜0.05表示有统计学意义。每个实验均进行了3次独立实验。

2 结果

2.1 miR-148a-3p结肠癌细胞系中低表达，SRPK2在结肠癌细胞系中高表达 首先检测了人结肠癌细胞中与人正常结直肠粘膜细胞FHC中miR-148a-3p及SRPK2的表达情况。结果显示，相对于FHC，结肠癌细胞系 HCT-116，SW480，LOVO和 SW620中 miR-148a-3p 表达降低（P＜0.05）（图 1a）。相反的，SRPK2 mRNA及蛋白在结肠癌细胞系中高表达（P＜0.05）（图 1b，1c）。在接下来的实验中，笔者选择HCT-116和SW480两种细胞进行实验。

图1 MiR-148a-3p及SRPK2在结肠癌细胞系中的表达Fig 1 The expression of miR-148a-3p and SRPK2 in colon cancer cell lines

2.2 miR-148a-3p抑制结肠癌细胞侵袭及转移 为了检测miR-148a-3p对结肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响，笔者进行了划痕试验和transwell试验。使用 miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor及对应NC转染结肠癌细胞。如图2a所示，miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p inhibitor可以明显增加和降低结肠癌细胞中miR-148a-3p的水平（P＜0.05）。划痕实验结果显示，过表达miR-148a-3p的结肠癌细胞相对迁移距离明显下降 （P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的结肠癌细胞相对迁移距离明显增加（P＜0.05）（图 2b）。此外，过表达 miR-148a-3p的结肠癌细胞穿透基质胶的细胞数目减少（P＜0.05），而敲低miR-148a-3p的结肠癌细胞穿透基底膜的细胞数目增加（P＜0.05）（图2c）。这些结果提示我们，miR-148a-3p可以影响结肠癌细胞迁移及侵袭能力。

图2 MiR-148a-3p对HCT-116及SW480迁移及侵袭能力的影响Fig 2 The effect of miR-148a-3p on migration and invasion of HCT-116 and SW480

2.3 MiR-148a抑制结肠癌细胞发生上皮-间质转化 上皮间质转化是肿瘤转移过程中的重要生物学过程之一。为了检测miR-148a-3p对结肠癌上皮间质转化的影响，笔者检测了上皮标志E-cadherin，间质标志N-cadherin及Vimentin的表达。结果如图3a，3b显示，过表达miR-148a-3p的结肠癌细胞E-cadherin 表达增加 （P＜0.05），N-cadherin 及 Vimentin表达降低 （P＜0.05）。而在miR-148a-3p敲低的结肠癌细胞中，E-cadherin表达明显降低 （P＜0.05），N-cadherin 和 Vimentin 表达明显增加（P＜ 0.05）。这些结果提示，miR-148a-3p可以抑制结肠癌细胞上皮-间质转化。

图3 MiR-148a-3p对HCT-116及SW480上皮-间质转化的影响Fig 3The effect of miR-148a-3p on epithelial-mesenchymal transition of HCT-116 and SW480

2.4 SRPK2是miR-148a-3p的直接靶点 为了阐明miR-148a-3p抑制CRC细胞迁移的潜在机制，笔者使用TargetScan 7.2和miRPathDB数据库预测了miR-148a-3p的可能靶点。预测结果显示SRPK2是miR-148a-3p的潜在靶点。为了证明SRPK2是miR-148a-3p的直接靶点，笔者进行了荧光素酶报告实验。将结合miR-148a-3p的野生型（Wt）或突变型（Mut）SRPK2序列克隆到 pGL3 Basic载体中（图 4a），并与miR-148a-3p mimic或miR-148a-3p inhibitor共转染293T细胞后检测荧光素酶活性。实验结果显示，miR-148a-3p mimic和Wt-SRPK2共转染的293T细胞中荧光素酶活性明显下降（P＜0.05）（图 4b）。相反，当 Wt-SRPK2和 miR-148a-3p inhibitor共转染到293T细胞中时，荧光素酶活性增加（P＜0.05）（图 4b）。这个结果提示，SRPK2 可能是miR-148a-3p的直接作用靶点。

图4 荧光素酶报告实验验证SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶点Fig 4 Verification of SRPK2 as a direct target of miR-148a-3p using the luciferase reporter assay

2.5 MiR-148a-3p抑制结肠癌细胞系中SRPK2的表达 为了证实miR-148a-3p对CRC细胞中SRPK2表达的影响，笔者进一步检测了miR-148a-3p mimic或inhibitor转染的CRC细胞中SRPK2的mRNA和蛋白质表达。结果显示，用miR-148a-3p inhibitor转染结肠癌细胞后，SRPK2的mRNA及蛋白水平明显增加（P＜0.05）（图 5a，5b）。相反的，用 miR-148a-3p mimic转染结肠癌细胞后，SRPK2的mRNA及蛋白表达明显降低（P＜0.05）（图 5a，5b）。这些结果提示，miR-148a-3p可以直接影响SRPK2表达。

图5 MiR-148a-3p对HCT-116及SW480中SRPK2表达的影响Fig 5 The effect of miR-148a-3p on the expression of SRPK2 in HCT-116 and SW480

3 讨论

MiRNA的失调与几乎所有类型的疾病相关，包括肿瘤[24]。许多研究已经证明miRNA失调在CRC发生和发展中起重要作用[25]。目前，miRNA的预后价值和潜在的作用机制仍有待进一步研究[26]。MiR-148a-3p在结肠癌的低表达可能与结肠癌的发生与不良预后有关[27-28]。但是目前miR-148a-3p在结肠癌中的调控作用还不完全明确。在本研究中，笔者发现miR-148a-3p在结肠癌细胞系中低表达。过表达miR-148a-3p可以抑制结肠癌细胞的转移及侵袭能力，同时抑制结肠癌细胞发生上皮间质转化。荧光素报告实验结果显示SRPK2是miR-148a-3p的直接作用靶点。在结肠癌细胞中过表达miR-148a-3p可以抑制SRPK2的表达。MiR-148a-3p可能通过SRPK2来影响结肠癌的进展。

MiRNA的失调与CRC的发生发展及耐药性的产生关系密切。例如，miR-34c-5p高表达肿瘤患者预后差，可以抑制结肠癌细胞的凋亡[29]。MiR-92b-3p可以促进结肠癌细胞增殖，转移及侵袭[30]。然而，并不是所有的miRNA均表现出肿瘤促进作用，很多研究已经显示有些miRNA在抑制肿瘤过程中起到重要的作用。例如，miR-233可以抑制结肠癌的增殖及促进凋亡[31]。MiR-206可以调节结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的抗性[32]。MiR-153可以抑制IDO1表达从而增强CART的治疗效果。在本研究中，笔者发现miR-148a-3p在结肠癌细胞中低表达，过表达miR-148a-3p可以明显抑制结肠癌的转移及侵袭能力。同时，miR-148a-3p过表达可以抑制结肠癌细胞发生上皮间质转化。

许多研究已经证明，miRNA主要通过调控其靶基因的表达发挥调控作用。例如，miR-218可以通过靶向cFLIP诱导结肠癌细胞凋亡[33]。本研究中，笔者通过TargetScan 7.2和miRPathDB数据库预测了miR-148a-3p的潜在靶点，结果提示SRPK2是miR-148a-3p的潜在靶点。荧光素酶活性实验提示，SRPK2是miR-148a-3p的直接靶点。但是，由于miRNA可能具有多个靶点，通过作用于不同的靶点可发挥不同的生物学作用。因此miR-148a-3p在结肠癌中的作用还需要进一步的探究。

SRPK2主要参与介导哺乳动物细胞中前体mRNA剪接因子的相互作用和定位[34]。近期的研究显示，SRPK2与肿瘤的侵袭与转移相关[23,35]。但是，SRPK2在肿瘤细胞中的表达调控机制还不完全清楚。肿瘤细胞发生上皮间质转化是肿瘤发生转移的重要过程之一。为了进一步探究miR-148a-3p调控SRPK2的表达是否影响结肠癌细胞的上皮间质转化，分别上调或者下调结肠癌细胞中miR-148a-3p的表达水平。在结肠癌细胞中过表达miR-148a-3p时，SRPK2 mRNA及蛋白表达降低，肿瘤的转移及侵袭能力受抑制。相反的，结肠癌中miR-148a-3p敲低时，SRPK2 mRNA及蛋白表达增加，结肠癌细胞转移及侵袭能力增强。因此笔者推测，miR-148a-3p可能通过影响SRPK2的表达，影响结肠癌细胞的上皮间质转化。因此，进一步通过Western blot检测了结肠癌细胞中上皮标志E-cadherin及间质标志N-cadherin和Vimentin的表达。结果显示，miR-148a-3p过表达，SRPK2表达降低的同时，E-cadherin表达增加，而N-cadherin和Vimentin表达降低。相反的，miR-148a-3p敲低时，SRPK2表达增加，上皮标志E-cadherin表达降低，间质标志N-cadherin和Vimentin表达增加。这些结果提示，miR-148a-3p可能通过调节SRPK2的表达，影响结肠癌细胞的上皮间质转化，改变结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。

综上所述，笔者发现miR-148a-3p在抑制结肠癌细胞转移及侵袭过程中起到了重要的作用，发现了miR-148a-3p调控结肠癌细胞转移及侵袭的新机制。结果显示miR-148a-3p过表达可以通过降低SRPF2表达抑制结肠癌细胞的转移及侵袭。miR-148a-3p/SRPK2可能参与结肠癌转移的调控，可能成为治疗结肠癌的新靶点。