DDX6突变体的构建

2019-05-05周焱琳唐翠兰于秀芝

浙江中西医结合杂志 2019年4期

周焱琳唐翠兰于秀芝

RNA解旋酶在多条RNA代谢通路中起到调控作用。在复杂的细胞环境中，它们可与细胞内多种信号通路、蛋白相互作用，参与调控致癌基因或抑癌基因的表达，参与癌症的发生发展。人类细胞表达约70种RNA解旋酶，大多数属于超家族2（superfamily 2，SF2）[1-2]。SF2 包括了 DEAD-box RNA 解旋酶（DEAD-box RNA Helicase，DDX RNA Helicase，DDX）蛋白家族，DDX蛋白是一类在进化中高度保守的ATP依赖的RNA解旋酶，广泛分布于人体的各个组织和器官中，包括肝、肾、心脏、结肠、阑尾、皮肤、唾液腺等等（数据来自 GioGPS，ID：1656）。它参与调节 RNA的多个过程，包括mRNA前体加工、RNA降解、翻译启动、转录调控等[3]。其家族蛋白的结构分为N端区、C端区和核心区。核心区位于N端区和C端区之间，包含9个保守结构域，包括该家族特征性氨基酸序列，即天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（D-E-AD）。由于家族成员在N端区和C端区结构域存在差异，导致其功能也出现了差别。有研究表明，家族中的DDX6在许多恶性细胞系中高度表达，其表达与癌症细胞的生长和分化密切相关。DDX6可在大肠癌、肝癌、胃癌中高度表达。它可以通过增加胃癌细胞中c-Myc表达来促进胃癌进展[4]。此外，它对胶质细胞瘤也有促进作用[5]。沉默DDX6，可以抑制结肠直肠癌细胞体外和体内的增殖[6]。人源DDX6又名RCK/p54，可从B细胞淋巴瘤细胞系RC-K8中克隆而来，其蛋白分子量为54kDa[7]。为了进一步明确DDX6在癌症进展过程中的作用，我们构建了DDX6突变体，使其失去解旋酶活性，或同时失去解旋酶和ATP酶活性，以期在后期实验中深入研究其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料质粒载体和菌株：DDX6-WT和pENTER购自维真生物科技公司（批号CH867745、PD88001）。细胞株：人肝癌Huh7细胞系由本实验室保存。

1.2 试剂 DH5α感受态细胞购自Simgen（8301010/8301020）；QIAGEN Plasmid Midi Kit 和QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司（批号12145、28704），PCR引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。Pro Ligation-Free Cloning Kit购自 abm 公司（批号 E086）。PrimeSTAR Max DNA Polymerase，DL15，000 DNA Marker和 DL5000 DNA Marker购自 Takara公司（批号 R045Q、3582Q、3428Q）。琼脂糖购自 BIOWEST（批号 111860）。LB 肉汤培养基、LB肉汤琼脂购自生工生物（批号A507002-0250、A507003-0250）。Pierce BCA Protein Assay Kit、AsiSI和 MLμL 购自 Thermo Fisher Scientific （批号 23225、FD2094、FD0564）。Lipofectine 3000和P3000购自美国Invitrogen（批号L3000015）。DMEM培养基购自Hyclone公司（批号SH30022.01）。胎牛血清、Opti-MEM培养基购自 Gibco（批号10099141、31985062）。0.25%胰酶+0.02%EDTA 溶液购自吉诺生物（批号GNM25200）。SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自碧云天生物技术（批号P0012A）。Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse、Dimethyl sμLfoxide （DMSO）购自 sigma-Aldrich（批号 F1804、V900090）。GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb购自Cell Signaling Technology（批号2118S）。Goat Anti-Mouse IgG （H+L）HRP 和 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP购自联科生物（批号70-GAM007、70-GAR007）。

1.3 方法

1.3.1 突变质粒的构建 DDX6-EQ突变质粒的构建：以DDX6-WT为模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和突变引物扩增整个模板。DDX6-EQ 突变上游引物（5’-3’）：TCCAGATGATAGTATTGGATCAGGCAGATAAGTTGCTGTCACAGGA；下游引物（5’-3’）TGACAGCAACTTATCTGCCTGATCCAATACTATCATCTGGACATGA。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，回收产物使用Pro Ligation-Free Cloning Kit试剂盒进行连接。连接产物命名为DDX6-EQ。DDX6-△C突变质粒的构建：以DDX6-WT为模板，使用AsiSI/MLμL进行双酶切，获取约1.4kb的目的片段和约7.5kb的载体片段。使用突变引物扩增目的片段，DDX6-△C突变上游引物（5’-3’）：TCCGGTACCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCCATGAGCACGGCCAGAACAGAGAAC；下游引物（5’-3’）：CCTTATAATCCTCGAGCGGCCGCGTACGCGTCAGGTTAATCTCATAGGG。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约0.9kb的片段，回收产物和载体片段使用Pro Ligation-Free Cloning Kit试剂盒进行连接，连接产物命名为DDX6-△C。

1.3.2 突变体的筛选与序列分析将突变后的质粒转入感受态细胞，在含有卡纳抗性的LB平板上涂板，37℃过夜后，挑取单菌落于37℃震荡培养过夜，提取质粒。将克隆子送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序，并对测序结果使用NCBI网站的BLAST平台进行核实。

1.3.3 突变体酶切鉴定用AsiSI和MLμL对突变后的质粒进行双酶切鉴定。起反应体系为：质粒DNA 1000ng，AsiSI 0.8μL，MLμL 0.8μL，10 ×Fastdigest buffer 2μL，ddH2O 补足 30μL。

1.3.4 细胞复苏溶液氮罐中取出Huh7细胞，37℃水浴，迅速融化细胞悬液。

1.3.5 细胞培养细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中贴壁生长。细胞培养于37℃、含5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内。每1天换一次液，每两天用含0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液的消化液进行传代。

1.3.6 细胞冻存待细胞生长到一定密度后，消化重悬细胞。将细胞悬液转移至15mL无菌离心管后，以800rpm的速度室温离心3min。离心后去上清，加入 700μL DMEM，200μL 胎牛血清，100μL DMSO，吹打数次重悬后，转移至无菌细胞冻存管中，于液氮中保存。

1.3.7 转染将Huh7细胞在6孔板中以0.5×106个/孔的密度铺板，24h后，当细胞融合率达50%～80%时，即可进行转染。转染前，将旧培养基弃去，加入新的血清培养基。将所需要的转染试剂和质粒按照实验量分别加入相应的Opti-MEM培养基中，轻柔吹打混匀，室温孵育5min。将转染混合物均匀逐滴加入细胞中，孵育48h。

1.3.8 蛋白质提取与蛋白印迹（Western Blot）分析使用RIRP裂解液提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，加入5×SDS Loading dye沸水浴10min变性。使用SDS-PAGE凝胶配置试剂盒配胶。将制备好的蛋白样本加入胶中，恒压电泳90V，当溴酚蓝前缘达到分离胶时，调节恒压电泳至120V，电泳直至溴酚蓝达到胶底部。电泳结束后立即转膜，恒压电流330V，1h。转膜结束后配5%BSA封闭液，室温封闭2h，可适当延长。根据抗体说明书和目的蛋白信号强弱，用5%BSA稀释一抗，一抗4℃孵育过夜。次日回收一抗稀释液，TBST洗膜三次，每次10min后，根据二抗说明书和目的蛋白信号强弱，以合适比例稀释二抗，二抗室温孵育1h。再用TBST洗膜三次，每次10min后，采用ECL发光。观察目的蛋白条带强弱趋势，分析实验结果。

2 结果

2.1 突变质粒的构建与酶切鉴定 DDX6-WT由483个氨基酸组成,其C端带有Flag和His标签蛋白。根据突变位置，分别命名无解旋酶活性的突变体和同时无ATP酶、解旋酶活性的突变体为DDX6-EQ（碱基序列第739位碱基由G突变为C，导致蛋白质序列第247位的谷氨酸（Glu）突变为谷氨酰胺（Gln）），和DDX6-△C（C端截去编码氨基酸的549个碱基，导致C端截去183个氨基酸）。突变体模式见插页图1。在表达载体pENTER的多克隆酶切位点上，DDX6-WT片段两端对应的限制性核酸内切酶位点为AsiSI和MLμL。使用AsiSl/MLμL双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，得到一条约7.5kb的载体pENTER片段和目的片段。目的片段分别约为1.4kb，1.4kb 和 0.9kb，见插页图 2。

2.2 序列分析将突变体送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序，将突变序列在BLAST中进行比较，在Chromas中核实，达到预期设计，见插页图3。

2.3 细胞水平蛋白验证在蛋白质水平使用Western Blot检测。将DDX6-WT和突变体分别转染入Huh7细胞后，孵育48h，收获细胞蛋白。Western Blot检测可见 DDX6-WT、DDX6-EQ、DDX6-△C 蛋白。DDX-WT和DDX6-EQ蛋白分子量为54kD，DDX6-△C蛋白分子量为34kD。符合预期，提示能正常表达相对应的蛋白，再次证实DDX6突变体构建成功，见插页图4。

3 讨论

RNA在许多细胞过程中发挥着重要作用，包括mRNA的剪切，核糖体生物合成和翻译。RNA分子拥有特异性二级和三级结构，尽管这些结构在调节RNA功能上发挥着至关重要的作用并引导着基因表达的调节，mRNA仍需要具有恰当结构的辅助分子来发挥其功能。特别是复杂的mRNA结构的解旋，这对于mRNA与核糖体结合进而翻译产生蛋白质非常重要。

RNA解旋酶被认为具有展开双链RNA（doublestranded RNA，dsDNA）的能力，或通过ATP水解释放能量来修饰RNA-RNA之间的相互作用[8-9]。DDX家族蛋白表现出典型的SF2的特征。在SF2中，与解旋功能相关的核心氨基酸残基构成共价连接的球状结构域，分别命名为区域1（domino 1，D1）和区域2（domino 2，D2），表现为 RecA-ATP 酶折叠。D1位于N端，包含基序Q、基序Ⅰ、基序Ⅰa、基序Ⅰb、基序Ⅱ和基序Ⅲ。D2位于C端，包含基序Ⅳ、基序Ⅴ、基序Ⅵ。基序Ⅰ和基序Ⅱ能与三磷酸腺苷（nucleoside triphosphate，NTP）和镁离子结合，调节NTP水解的功能。在这两基序中间的基序Ia和基序Ib则能调节核酸的结合。基序Ⅲ与NTP的水解活动相关。基序Ⅳ、和基序Ⅴ与RNA的结合相关。基序Ⅵ则涉及了与NTP水解有关的构象变化[3]。

有临床试验通过免疫组织化学研究发现，28例直肠癌患者中，54%的患者表现出DDX解旋酶过度表达。DEAD box蛋白MrDb是c-Myc基因的一个靶蛋白，可以显著地促进细胞增殖。研究证实，RCK/p54参与了癌基因如c-Myc、E1A或其他生长相关基因的mRNA翻译，这可能是因为RCK/p54本身与癌基因c-Myc、E1A或其他生长相关基因等相关联[10]。MicroRNA（miRNA）在蛋白质合成的过程中起到关键作用，在miRNAs诱导的的沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRISC）的影响下，miRNA可靶向mRNA的翻译，加快mRNA的凋亡。mRNA的降解起始于脱腺苷酶复合物CCR4-NOT缩短多聚A尾，随后5’帽结构被移除，mRNA被核酸外切而降解。CCR4-NOT的组分CNOT1与DDX6可直接结合。如果打断DDX-CNOT1之间的结合，可损伤miRISC介导的人类基因沉默[11]。在结肠癌中，miR NA124能直接靶向DDX6，抑制DDX6的翻译，诱导结肠癌细胞的凋亡[12]。DDX家族蛋白eIF4A存在于真核细胞转录起始因子4F（eukaryotic translationinitiation factor 4F，eIF4F）复合体中，能联合p220和帽结合蛋白eIF4E在翻译起始中发挥重要作用。因此，DDX6能够促进基因细胞mRNA的翻译、增殖和恶性转移。另外，miR-143和miR-145作为肿瘤抑制因子，被宿主基因NCR143/145调控，DDX6可以通过下调NCR143/145的表达来促进胃癌的进展，在人胃癌样本中，DDX6表达量远高于正常胃组织[13]。但对于其功能域具体怎样发挥作用尚不清楚。

在本研究中，我们利用引物引入突变，截去DDX6的D2区域，使其失去ATP酶和解旋酶活性，将该突变体命名为DDX6-△C，或使DEAD区域上的碱基发生点突变，使其由编码谷氨酸变为编码谷氨酰胺，失去解旋酶活性，将该突变体命名为DDX6-EQ并用Western Blot检测其蛋白表达水平，这为进一步研究DDX6在癌症进展过程中的作用提供实验基础。