女贞子多糖在大鼠睾丸支持细胞炎性损伤中对能量代谢保护作用的研究

翁碧霞 娄江涛 周 俊 魏任雄

炎症是常见的危害男性生殖健康的因素之一，也是造成男性不育症发生发生的重要原因。炎症反应对细胞正常功能的影响是多方面的，可造成细胞正常功能的低下或缺失。睾丸支持细胞是精子发生和发育的摇篮，在生精小管内，每个睾丸支持细胞（Sertoli cell）上都附着十几个处于各发育阶段的精子细胞，其在为精子发生发育提供营养物质如乳酸盐等必须的能量物质和免疫保护，而炎症的发生势必造成睾丸支持细胞功能的损伤[1-2]。女贞子（Fructus Ligustri Lucidi Ait）系木犀科女贞属植物，是一味传统中药材，具有扶正固本，滋补肝肾，养阴益精作用，是治疗男性不育的常用中药[3]。而女贞子多糖（Ligustri Lucidi Ait Polysaccharide，LLP）是中药女贞子有效成份之一。我们前期研究发现，在炎症条件下，其对睾丸支持细胞的免疫分泌功能具有调节作用，但是否对细胞的代谢功能具有保护作用还不清楚。而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分之一，极少量的LPS在细胞内就能引起广泛的炎症反应，影响细胞的代谢功能。本研究拟通过睾丸支持细胞体外培养，探讨LLP含药血清在LPS诱导炎症条件下是否对Sertoli细胞代谢功能具有保护作用，为女贞子在治疗男性不育方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠10只，体质量150～170g，由上海斯莱克动物有限公司提供（动物生产许可证号SCXK（沪）2012-0002）。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[动物使用许可证号SYXK（浙）2013-0184]，室内温度（24±2）℃，相对湿度 40～60%，自由进食水，适应性饲养两周备用。

1.2 试剂和仪器 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Hyclone公司（批号0781003、SH30848.01B、SV30087.03）、Ⅱ型胶原酶购于上海李记生物科技有限公司（批号C5100L0041）；96、24和12孔细胞培养板购自美国Coming公司；CCK-8购自上海碧云天生物技术公司（批号CZ677）；三磷酸腺苷（ATP）、乳酸（LD）、乳酸脱氢酶（LDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司 （批号 20170314、20170415、20170106、20170218），兔抗大鼠Fas L多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体均购自北京百奥莱博科技有限公司（批号K1563、BL0817）；倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），CO2培养箱（德国Heraceu公司），超净工作台（苏州华宇净化设备有限公司）,酶标仪（科华ST-360），紫外分光光度计（UV-1800型）。

1.3 女贞子多糖含药血清的制备 女贞子多糖为棕色粉末，多糖含量大于50%，由宁波市药品检验所提供。选取8只SD雄鼠采用随机数字表法分为高剂量LLP组、中剂量LLP组、低剂量LLP组和阴性对照组，每组2只。高剂量LLP组按照每日4g/kg、中剂量LLP组按照每日2g/kg、低剂量LLP组按照每日1g/kg女贞子多糖连续灌胃10天，对照组采用蒸馏水（1mL/100g）灌胃10天，最后一次给药2h后处死并取血，分别制备高、中、低剂量女贞子多糖含药血清和正常血清备用。

1.4 睾丸支持细胞原代培养鉴定 Sertoli细胞分离培养、纯化和培养方法参考文献[4]，Sertoli鉴定采用特异FasL抗体免疫组化进行鉴定，支持细胞纯度=FasL阳性细胞数/细胞总数×100%，纯度达到90%后备用。实验分为分为阴性对照组、LPS组和3个LPS+LLP组。LPS终浓度为5μg/mL，三个LPS+LLP组分别加入培养体积10%的高、中、低剂量女贞子多糖含药血清，对照组加入培养体积10%正常血清，LPS组加入培养体积10%正常血清和LPS,每组5复孔。将处于对数生长期的细胞依据不同实验目的分别接种于96孔、24孔和12孔培养孔内，当细胞融合到约30～50%后，将LPS加入LPS刺激组和三个女贞子+LPS组，不同浓度女贞子含药血清加入LPS+低剂量LLP组、LPS+中剂量LLP组、LPS+高剂量LLP组后继续培养48h后备用。

1.5 CCK-8法测定细胞增殖活性 选用上述96孔板内培养的各组细胞，分别加入CCK-8 10μl，孵箱培养60min后酶标分析仪450nm测定各组吸光度值。

1.6 细胞内ATP、LD含量和LDH、SDH活力的测定收集各组细胞，并用预冷的生理盐水清洗3次，每个待测样品中加入0.2mL生理盐水进行匀浆并置于冰上匀浆裂解细胞。采用相关试剂盒测定ATP、LD含量和LDH、SDH活力，具体操作方法严格按照试剂盒说明书进行。测定结果采用蛋白含量进行标化

1.7 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（s） 表示，多组间均数比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 睾丸支持细胞分离鉴定 原代Sertoli细胞分离培养后呈不规则形，FasL高表达于胞浆中，免疫组化染色可见胞质内有大量棕黑色颗粒，即为支持细胞，纯度＞95%。

2.2 CCK-8检测细胞增殖结果 对照组、LPS组、LPS+低剂量LLP组、LPS+中剂量LLP组和LPS+高剂量LLP组OD值比较差异有统计学意义（P＜0.01）。方差齐性检验（P＞0.05），组内两两比较采用LSD法。LPS组与对照组相比细胞增殖活性明显减弱（P＜0.01）。与LPS组相比三组LPS+女贞子多糖组细胞增殖活力有不同程度的增强，见表1。

2.3 细胞内ATP、LD含量检测结果 各组细胞ATP和LD含量组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.01），LPS组中ATP、LD 含量与对照组相比显著降低（P均＜0.01），LPS+LLP组与LPS组相比ATP、LD含量均随LLP浓度的增加而逐渐增加（P均＜0.05），见表 2。

表1 各组细胞增殖活性比较

表2 睾丸支持细胞ATP和LD 含量测定结果（nmol/mL±s）

表2 睾丸支持细胞ATP和LD 含量测定结果（nmol/mL±s）

注：与对照组相比较，*P＜0.01；与 LPS 组相比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；ATP：三磷酸腺苷；LD：乳酸；LPS：脂多糖；LLP：女贞子多糖；对照组予蒸馏水1mL/100g灌胃；LPS组经浓度为5μg/mL；LPS+低、中、高剂量LLP 组分别为 1g/kg、2g/kg、4g/kg灌胃

组别空白对照组LPS组LPS+低剂量LLP组LPS+中剂量LLP组LPS+高剂量LLP组孔数5 5 5 5 5 ATP 87.47±4.88 36.41±3.67*40.34±4.40△55.35±6.54▲65.34±5.27▲LD 107.21±7.47 44.91±3.39*49.54±4.67△55.32±5.44▲76.08±0.42▲

2.4 细胞内LDH、SDH活力检测结果 各组细胞LDH和SDH活力组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.01），LPS组中LDH和SDH活力与对照组相比显著降低（P均＜0.01），LPS+LLP组与LPS组相比LDH和SDH活力均随LLP浓度的增加而逐渐增加（P 均＜0.05），见表 3。

表3 睾丸支持细胞LDH和SDH活性检测（U/mL

表3 睾丸支持细胞LDH和SDH活性检测（U/mL

注：与对照组相比较，*P＜0.01；与 LPS 组相比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；LDH：乳酸脱氢酶；SDH：琥珀酸脱氢酶；LPS：脂多糖；LLP：女贞子多糖；对照组予蒸馏水1mL/100g灌胃；LPS组经浓度为5μg/mL；LPS+低、中、高剂量 LLP 组分别为 1g/kg、2g/kg、4g/kg灌胃

组别空白对照组LPS组LPS+低剂量LLP组LPS+中剂量LLP组LPS+高剂量LLP组孔数5 5 5 5 5 LDH 98.54±6.59 34.25±3.25*39.27±4.24△45.09±7.54▲57.54±4.37▲SDH 132.54±7.44 54.24±4.24*59.87±5.34△65.62±7.27▲72.13±6.37▲

3 讨论

炎症是影响男性生殖的常见病因之一，其对男性生殖系统细胞功能影响广泛，可诱发多种男性生殖疾病，如睾丸炎、男性免疫性不育症等。Sertoli细胞是精子发生发育的保姆，在生精小管内，每个Sertoli细胞的表面都哺育这十几个处于不同发育阶段的精子细胞，为精子发生发育提供多种营养物质[5]。同时研究发现Sertoli细胞代谢的改变可直接影响精子的发生过程[6]。精子细胞的生长发育需较高的能量，其能量供给底物主要为乳酸而非葡萄糖。睾丸支持细胞可将葡萄糖转化为乳酸，为精子细胞提供能量来源[7]。有研究发现，当没有足够乳酸供应时，精子细胞将会发生退化和凋亡[8]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，也是一种主要的致炎因子，能诱多种细胞分泌炎性细胞因子，造成炎症损伤。研究表明，LPS可造成睾丸支持细胞的多种功能受损，如分泌蛋白功能，Sertoli细胞间紧密连接等，同时还能影响Sertoli细胞的代谢[9]。本研究亦发现，LPS可造成Sertoli细胞分泌LD含量降低。在糖酵解代谢途径中，乳酸的生产主要由LDH 催化丙酮酸产生，因此细胞内LDH的活力将直接影响到乳酸生成。本研究结果显示，与对照组相比，LPS组细胞LDH的活力明显下降。SDH是三羧酸循环中唯一存在于线粒体内膜上的酶，是线粒体的标志酶，因此SDH活力可作为评价细胞线粒体功能重要指标。同时在三羧酸循环中，SDH催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，脱下的氢最后生成ATP。ATP是细胞生命活动的直接供能者，亦是睾丸支持细胞维持正常功能的前提。本研究发现，LPS可造成Sertoli细胞SDH活性下降，同时ATP含量亦降低。

女贞子是系木犀科女贞属植物，其性味甘、苦、凉，归肝、肾经，具有扶正固本，滋补肝肾，养阴益精作用，是临床治疗男性不孕症的常用中药成份[10]。主要药物有效成份为齐墩果酸、红景天苷和女贞子多糖等。现代药理学研究表明，女贞子多糖具有抗氧化、调节免疫等多种功效。本研究进一步发现女贞子多糖可明显减轻LPS对Sertoli细胞能量代谢关键酶SDH和LDH的酶活性的损伤，进而有效提高LD和ATP的含量。而这一作用可能是其能提高细胞增殖，减少细胞凋亡的原因之一。

女贞子具有滋补肝肾，养阴益精作用，本研究发现女贞子多糖可有效减轻LPS对sertoli细胞造成代谢功能损伤，提示其可能对细胞的代谢具有一定的调节作用，这为中药女贞子在治疗男性生殖系统疾病中的药理作用提供了一定的实验基础，但炎症是一个复杂的病理过程，女贞子多糖是否对睾丸支持细胞代谢功能具有直接调节功能而不是通过对其它功能（如免疫调节）调节而间接影代谢能能还有待进一步研究。