扶正化瘀胶囊对气虚血瘀型肝纤维化模型大鼠细胞自噬基因LC3Ⅱ和p62的干预作用

2019-05-05徐渴阳苏晓倩包剑锋

浙江中西医结合杂志 2019年4期

徐渴阳苏晓倩包剑锋

肝纤维化是病毒、酒精、脂肪等各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生，及早阻断和逆转肝纤维化是防治肝硬化的关键[1]。肝纤维化属于中医“胁痛”、“臌胀”、“积聚”等范畴，肝纤维化患者中，临床以气虚血瘀型最为多见。细胞自噬是指细胞在受到内外环境刺激后，通过包裹自身受损蛋白质、细胞器形成自噬小体后自我消化，以维持内环境稳定和应对刺激因素的生化过程。而细胞自噬可诱导肝星状细胞激活，促进肝纤维化进展[2]。有研究提示细胞自噬与气虚血瘀相关，气虚则精微物质不足，通过自噬消化胞内多余或损伤的细胞（血瘀等实邪）代为补偿[3]。LC3Ⅱ是自噬标志蛋白，可抑制肝星状细胞活化，进而抑制肝纤维化[4]。而p62是一种寡聚蛋白质，通过与自噬标志物LC3Ⅱ结合，从而被选择性自噬降解[5]。扶正化瘀胶囊可益精养肝、活血祛瘀，具有一定的抑制肝纤维化作用[6]。本研究旨在，明确细胞自噬基因LC3Ⅱ、p62与气虚血瘀型肝纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物清洁级SD大鼠40只，雄性，体质量（150±10）g，由浙江中医药大学实验动物中心[合格证号：SYXK（浙）2013-0184]提供，预养 7天后进入实验阶段。饲养期间给与给予标准饲料及自由饮水，12h循环黑白灯光，恒定温湿度。

1.2 药品及试剂四氯化碳（CCl4，由国药集团化学试剂有限公司生产，批号20160621）；橄榄油（由国药集团化学试剂有限公司生产，批号20161111）；扶正化瘀胶囊（由上海黄海制药有限责任公司生产，批号161103）；LC3Ⅱ上游引物 5’-GATGTCCGACTTATTC GAGAGC-3’,下游引物 5’-TTGAGCTGTAAGCGCCT TCTA-3’；p62 上游引物 5’-ATCAGCTTCTGGTCCAT CGG-3’，下游引物 5’-GCTTCTTTTCCCTGTGCT-3’；β-actin 上游引物 5’-CCCATCTATGAGGGTTAC GC-3’，下游引物 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’；（引物由上海桑尼生物科技有限公司设计合成）；Anti-SQSTM1/p62 antibody：Abcam，批号ab56416；Anti-LC3B antibody：Sigma，批号 L7543；Anti-GAPDH antibody：联科，批号 mab5465。

2 实验方法

2.1 分组将40只SD大鼠按照随机数字表法分为四组：正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组和扶正化瘀治疗组，每组10只。

2.2 模型制备肝纤维化模型制备：将CCl4与橄榄油按4：6比例配40%油剂。按0.3mL/100g剂量，对肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组、扶正化瘀治疗组大鼠予以皮下注射，每周2次，连续6周。气虚血瘀型肝纤维化模型制备：在肝纤维化模型制备的基础上，气虚血瘀肝纤维化组及扶正化瘀治疗组大鼠自第4周始加用游泳疲劳试验，将肝纤维化大鼠放入水温10°C、四壁光滑的大水桶中，连续游泳，至疲劳后下沉为止，早晚2次，持续造模2周。本课题组前期对肝纤维化模型、气虚血瘀肝纤维化模型的制备积累了丰富经验，并基于这两个模型发表论文多篇[7-8]。

2.3 药物干预 7周始，正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组大鼠予以生理盐水2mL灌胃，1天1次，连续4周。扶正化瘀治疗组大鼠用药剂量按照实验动物研究“等效剂量”的计算方法，给予扶正化瘀胶囊，按0.5g/kg体质量灌胃，药物用生理盐水按0.5g/mL浓度配比，1天1次，连续用药4周。中药干预过程中，观察大鼠行精神状况、活动情况、毛发、食欲及大便性状等。

2.4 标本采集和处理 10周末疗程结束后处死全部大鼠，获取肝组织标本。取大鼠肝脏右叶，立即用10%中性磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS）福尔马林液中固定24h，按 1cm×1cm×0.2cm大小取材，标记后流水冲洗30min，梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡，常规石蜡包埋，连续切片，予苏木素-伊红染色和苦味酸-天狼星红染色。苏木素-伊红染色观察肝组织炎症、细胞变性和纤维化情况，苦味酸-天狼星红染色显示肝组织胶原纤维增生情况，两者对照，判定肝组织纤维化程度，采用Ishak评分评价各组肝脏纤维化程度[8]。余组织液氮冷冻备份。

2.5 RT-PCR Trizol-离心柱法提取肝组织总RNA，测定RNA纯度和含量，反转录、扩增后对LC3II、p62 mRNA定量。mRNA相对表达量公式如下：mRNA 相对表达量=靶 mRNA/βactin。

2.6 Western blot根据样本细胞量加入 100μL IP裂解液裂提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，随后聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜，最后ECL化学发光显影，分别检测LC3II、p62、GAPDH 蛋白表达。Western blot采用 Image J软件计算灰度值，公式如下：靶蛋白相对表达量=靶蛋白/GAPDH。

2.7 统计学方法应用SPSS22.0统计软件，数据资料以均值±标准差（s）表示，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠体质量及肝湿重情况气虚血瘀肝纤维化组大鼠体质量及肝湿重最低（P＜0.05），经扶正化瘀治疗后接近正常水平（P＜0.05），见表1。

3.2 各组大鼠肝组织天狼星红染色正常组肝细胞排列整齐，无纤维增生；肝纤维化组：可见较为明显的红色胶原纤维,肝小叶结构明显破坏，可见部分假小叶；气虚血瘀肝纤维化组可见明显的红色胶原纤维，桥接样坏死，可见大面积假小叶；扶正化瘀治疗组可见红色胶原纤维有所减少，见插页图1。

3.3 各组大鼠肝纤维化Ishak评分比较气虚血瘀肝纤维化组炎症评分、肝纤维化评分以及Ishak评分均高于肝纤维化组（P＜0.05），经扶正化瘀软胶囊治疗后，评分均有所降低（P＜0.05），见表 2。

表1 各组大鼠体质量及肝湿重情况（g

注：与正常组比较，*P＜0.05；与肝纤维化组比较，△P＜0.05；与气虚血瘀肝纤维化组比较，▲P＜0.05；正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组给予生理盐水灌胃；扶正化瘀治疗组给予0.5g/kg体质量扶正化瘀胶囊混悬液灌胃

组别正常组肝纤维化组气虚血瘀肝纤维化组扶正化瘀治疗组鼠数10 10 10 10体质量423.40±30.18 391.50±24.52*356.10±20.45*△375.80±24.36*▲肝湿重10.95±0.85 11.52±0.95 10.34±1.13△11.31±1.13▲

表2 各组大鼠肝纤维化Ishak评分比较（分

组别正常组肝纤维化组气虚血瘀肝纤维化组扶正化瘀治疗组鼠数10 10 10 10炎症坏死评分0 11.80±1.80*14.20±1.70*△10.20±1.50*▲肝纤维化评分0 3.90±1.20*5.80±0.80*△2.70±0.90*▲

3.4 各组大鼠LC3Ⅱ、p62 mRNA表达水平比较LC3ⅡmRNA表达在气虚血瘀肝纤维化组最高，经扶正化瘀软胶囊治疗后显著下降（P＜0.05）；而p62 mRNA在气虚血瘀肝纤维化组最低，经扶正化瘀软胶囊治疗后显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠LC3Ⅱ、p62 mRNA表达水平比较（

组别正常组肝纤维化组气虚血瘀肝纤维化组扶正化瘀治疗组鼠数10 10 10 10 LC3Ⅱ1.10±0.03 1.23±0.01*1.44±0.01*△1.20±0.01*▲P62 1.20±0.06 1.10±0.01*0.95±0.05*△1.12±0.01*▲

3.5 各组大鼠LC3Ⅱ、p62蛋白表达水平比较 LC3Ⅱ 蛋白表达在气虚血瘀肝纤维化组最高，经扶正化瘀软胶囊治疗后显著下降（P＜0.05）；p62蛋白在在气虚血瘀肝纤维化组最低，经扶正化瘀软胶囊治疗后显著升高（P＜0.05），见表 4、插页图 2。

4 讨论

研究表明，细胞自噬可造成脂滴降解为肝星状细胞活化提供ATP，进而肝星状细胞持续活化促进肝纤维化进展[9]。LC3Ⅱ作为细胞自噬蛋白，可通过调控p62介导肝星状细胞活化[10]。而细胞自噬的病理生理机制与中医气虚血瘀证相关，并通过补气活血方取得一定疗效[11]。本研究结果显示，气虚血瘀组LC3Ⅱ表达最高，下游蛋白p62表达最低，提示气虚血瘀细胞自噬水平升高。而通过扶正化瘀胶囊益气扶元、活血化瘀，下调细胞自噬蛋白LC3Ⅱ，上调p62，可抑制细胞自噬水平。

表4 各组大鼠LC3Ⅱ、p62蛋白相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与肝纤维化组比较，△P＜0.05；与气虚血瘀肝纤维化组比较，▲P＜0.05；正常组、肝纤维化组、气虚血瘀肝纤维化组给予生理盐水灌胃；扶正化瘀治疗组给予0.5g/kg体质量扶正化瘀胶囊混悬液灌胃

组别正常组肝纤维化组气虚血瘀肝纤维化组扶正化瘀治疗组鼠数10 10 10 10 LC3Ⅱ1.84±0.21 2.63±0.35*3.01±0.57**△2.04±0.30△▲P62 1.10±0.23 0.38±0.17**0.19±0.12**△0.67±0.32△▲

中医认为，细胞自噬多以阴阳、虚实为基础[12-14]。黄贵华等[3]认为，自噬是对机体正虚邪实作出的一种自我调节方式。自噬既是正气亏虚下的自救方式，同时也是机体转化、消除内生实邪（如痰浊、瘀血等）的方式。刘杰民等[12]认为，细胞自噬与机体脏腑功能失调下，内生痰浊瘀血之实邪的自我清除以维持内环境的阴阳平衡，以及中医气虚情况下通过“精化气”，以维持机体生命活动的机制相一致。人体是一个有机的整体，《素问·生气通天论》说，“阴平阳秘精神乃治”，正常状态下细胞自噬处于基础水平，阴长阳消、阴消阳长，使机体细胞处于稳态。当细胞自噬太过、自噬蛋白LC3Ⅱ蓄集则血瘀，而自噬底物p62消耗太过则气虚。气虚则推动无力，容易导致病理产物LC3Ⅱ堆积，而病理产物的堆积又会使气机不调，加重气虚。正如肝纤维化形成后细胞自噬反而呈活跃状态。

综上所述，本研究结果显示，气虚血瘀肝纤维化大鼠细胞自噬蛋白LC3Ⅱ表达增加，促使自噬底物p62表达减少。扶正化瘀胶囊干预可以抑制细胞自噬水平改善肝纤维化程度。