内蒙古呼和浩特市摇蚊鉴定与COI基因序列分析

元正菊，刘威，李楠，孟锦昕，何于雯，王静林*

(1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224； 2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031)

摇蚊科(Chironomidae)属于动物界、节肢动物门、六足亚门、昆虫纲、有翅亚纲，隶属双翅目、长角亚目[1]。全世界广泛分布，遍及各大动物地理分布区[2]。目前已被描述的摇蚊种类超过6000种[3]。摇蚊成虫几乎不取食，或者摄食少量含糖分的液体。幼虫是水体中分布范围广的一类水生昆虫，其中一些种类对水质的变化如营养盐、重金属、pH和溶解氧等极为敏感，另有些种类则适应有机污染、重金属类毒物污染[4]。在水质的生物学评价工作中利用其种类敏感和耐污染特性，反应水质的变化和污染程度，是生物监测的重要评价依据[4-6]。国内有关摇蚊的研究近年来多偏重于成虫的分类学研究[4]，但专门研究报道的不多，缺乏完整、系统的资料。为此，2016年在内蒙古呼和浩特市采集摇蚊，并采用形态学和分子生物学方法对摇蚊进行了系统鉴定，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2016年7月，在内蒙古呼和浩特市周围农户家牛圈采用诱蚊灯(功夫小帅，12 V，300 mA，湖北武汉) 进行标本采集[7]，采集时间段约为晚间18：00至次日早晨8：00，共14h。次日早晨将标本收集，置于-20℃冰箱中冷冻20～30min，待存活的摇蚊刚好冷冻至死后，取出标本，剔除其他昆虫，将摇蚊标本置于70%乙醇中保存。

1.2 摇蚊形态学鉴定

从乙醇中取出摇蚊标本，在解剖显微镜下进行形态观察，并进行计数。

1.3 DNA提取及PCR扩增

挑选形态完整、形态学鉴定为摇蚊的标本，浸泡在含有1%蛋白酶K的240μL浸储液中，40℃消化过夜。用DNA提取试剂盒(天根公司)按说明书提取摇蚊DNA。操作步骤如下：将浸泡过夜的浸储液全部移入无菌离心管中，加入20μL Proteinase K溶液，混匀，56℃放置10min；加200μL缓冲液GB和1μL Carrier RNA储存液，混匀，70℃放置10min；加200μL无水乙醇充分混匀，过柱，分别用500μL缓冲液GD和600μL漂洗液PW洗涤。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液TB洗脱DNA。采用25μL体系，取2μL cDNA做反应模板，用COI特异引物[7]进行PCR扩增，依次加入10×Buffer 2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2μL、上下引物各0.5μL、ddH2O 9.5μL,94℃预变性5min。94℃ 40s，47℃ 40s，72℃ 1min，5个循环。94℃ 40s，53℃ 40s，72℃1min，30个循环。72℃延伸10min。1%琼脂糖电泳检查扩增条带，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit纯化PCR扩增产物，PCR扩增产物通过华大基因公司进行测序。

1.4 序列分析

使用Clustal X Version 2.1 软件包进行病毒基因核苷酸序列比对， DNA Star软件中MegAlign进行核苷酸同源性分析。使用MEGA 4.1 软件完成基于最大似然法(ML)方法的进化树绘制，最佳模型(GTR+G+I)，bootstrap值为1000。

2 结果

2.1 摇蚊采集

2016年7月在内蒙古呼和浩特市采集摇蚊41只，其中雌蚊38只(92.68%)、雄蚊3只(7.32%)。

2.2 形态学鉴定

本研究采集的41只摇蚊标本中，有9只摇蚊头部较小而扁圆，复眼发达，两复眼间有一黑色纽扣样突起相连(图1-b)。无单眼。触角柄节退化几乎不可见；梗节发达，球状；鞭节共5节，I-IV节浅黄色泡状膨隆，V节深褐色丝状。口器退化，上唇及下唇均成简单的肉质叶(图1-c)。前胸很小，头后至胸前有一窄条、衣领状的前胸背板。中胸盾片具有3条品字形排列的黄褐色纵走骨化带(图1-c)。中胸小盾片显著，浅黄色半球形凸起(图1-c)。小盾片后方的后背片深褐色，有一纵走中缝。中胸腹侧板深褐色(图1-c)。翅透明一色，无鳞片。翅前缘有3条径脉而互不相接，不形成径室(图1-i)。腹部I-V节深褐色、白色环形相间，其余腹节浅黄色(图1-a)。

有32只摇蚊体色较浅(图1-d)。头部较小而扁圆，复眼发达，两复眼间距宽(图1-e)。触角柄节退化几乎不可见；梗节发达，球状；鞭节共5节，I-IV节浅黄色泡状膨隆，V节深褐色丝状(图1-f)。口器退化，上唇及下唇均成简单的肉质叶(图1-e)。前胸很小，头后至胸前有一窄条、衣领状的前胸背板。中胸盾片具有3条品字形排列的黄色纵走骨化带。小盾片显著，半球形，白色。中胸后背片、中胸腹侧板黄色，其余胸部白色(图1-g)。腹部浅灰及白色(图1-d)。

a b c

d e f

g h i

2.3 核苷酸同源性分析

对内蒙古采集到的3只形态学鉴定为摇蚊的标本(均为雌性)进行DNA提取和COI基因PCR扩增，3只标本扩增均为阳性，经序列测定获得557个核苷酸序列。3只摇蚊COI基因核苷酸同源性为83.5%～100%，其中HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊COI基因核苷酸同源性为100%，而与HS1-3-2摇蚊核苷酸同源性仅为83.5%，提示HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊为同一种摇蚊，而HS1-3-2为不同摇蚊种类。3只摇蚊COI基因核苷酸与Genebank中8种已知摇蚊相应序列一起进行分析(见表1)，HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊与Ch.riparius核苷酸同源性最高为99.8%，与Ch.thummi同源性为99.5%，与其他已知摇蚊同源性均低于90%；HS1-3-2摇蚊与Ch.muratensis核苷酸同源性最高为99.6%，与Ch.annularius和Ch.commutatus同源性分别在97.1%和94.6%，而与其他摇蚊同源性均低于90%。

表1 内蒙古古呼和浩特市摇蚊COI基因核苷酸序列同源性分析 %

2.4 COI基因系统进化分析

采集的3只摇蚊COI基因与GenBank中不同摇蚊种类相应基因序列一起构建系统进化树，最佳模型选用GTL+G+I模型，见图2。结果显示在COI基因构建系统进化树上采集的3只摇蚊分别位于两个进化分支内，其中HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊与Ch.riparius处于相同化分支内，而HS1-3-2摇蚊与Ch.muratensis处于相同化分支内。以上结果提示HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊可能是Ch.riparius，而HS1-3-2摇蚊可能是Ch.muratensis。

遗传进化树采用最大似然法(ML)构建，最佳模型(GTR+G+I)；圆点代表本次采集蚊虫标本 图2 内蒙古采集摇蚊COI基因(557nt)遗传进化分析

3 讨论

本次研究在内蒙古呼和浩特市周围农户家牛棚共采集摇蚊41只，9只摇蚊具有体深褐色，复眼发达，两复眼间有一黑色纽扣样突起相连。触角鞭节共5节，I-IV节浅黄色泡状膨隆，V节深褐色丝状。口器退化，前胸很小，中胸盾片具有3条品字形排列的黄褐色纵走骨化带。中胸小盾片显著，浅黄色半球形凸起。小盾片后方的后背片深褐色，有一纵走中缝。中胸腹侧板深褐色。翅透明，无鳞片。翅前缘有3条径脉，而互不相接，不形成径室。腹部I-V节深褐色、白色环形相间，其余腹节浅黄色等形态学特征，与Ch.riparius相似的形态学特征，提示这9只摇蚊为Ch.riparius。

32只摇蚊具有体色较浅，复眼发达，两复眼间距宽。触角鞭节共5节，I-IV节浅黄色泡状膨隆，V节深褐色丝状。口器退化，前胸很小，中胸盾片具有3条品字形排列的黄色纵走骨化带，小盾片显著，半球形，白色，中胸后背片、中胸腹侧板黄色，其余胸部白色，腹部浅灰及白色，与Ch.muratensis相似的形态学特征，提示这32只摇蚊为Ch.muratensis。进一步采用分子生物学方法在41只摇蚊中挑选3只进行鉴定，结果显示HS1-1-1和HS1-1-2两只摇蚊与Ch.riparius处于相同化分支内，它们之间的核苷酸同源性高于98%(蚊虫种类鉴定标准)[8]；HS1-3-2摇蚊与Ch.muratensis处于相同化分支内，它们之间的核苷酸同源性也高于98%；分子鉴定结果显示它们分别是Ch.riparius及Ch.muratensis，这与形态学鉴定结果一致。本研究采用形态学及分子生物学方法对摇蚊进行了系统的分类鉴定，丰富了我国摇蚊种类资源，为生态环境、水体污染的进一步研究提供了科学依据。

摇蚊并不传播疾病，不是卫生害虫。但因其不同的种类对于水域生态环境要求不同，使其成为监测水体环境及污染状况的指示生物[4]。此外，摇蚊和蠓虫原先同属于一个属，1917年才独立成科。这两科昆虫形态学特征有很多相似之处[1]，在野外采集时给这两种昆虫的鉴定带来了困难。而蠓虫能够传播蓝舌病、鹿流行性出血热、非洲马瘟、奥西罗热等多种人或动物疾病[9]，是医学上一种重要的传播媒介，在现场简单快速鉴别出摇蚊与蠓科昆虫，对虫媒病、人畜共患病及畜牧业发展研究具有重要意义。