云南省双江县4种多足摇蚊翅膀形态特征及COI基因序列分析

杨绍昌，浦朝忠，何于雯，孟锦昕，李楠，王静林*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224； 2.双江县畜牧兽医技术推广中心，云南 双江 677399；3.双江县勐勐镇农业农村服务中心，云南 双江 677399)

摇蚊科昆虫(Chironomidae)属于昆虫纲、有翅亚纲、双翅目、长角亚目[1]。2012年全世界已经记录了11个亚科400多个属6300多种摇蚊[2,3]。在中国目前已记录有大约1000种摇蚊，分布在长足摇蚊亚科、直突摇蚊亚科、原寡角摇蚊亚科、寡角摇蚊亚科、寡脉摇蚊亚科、滨海摇蚊亚科、摇蚊亚科等7个亚科，139个属[4]。摇蚊在全球地理分布区域非常广泛，其幼虫在淡水水体中种类最多。摇蚊在环境监测、水产品良好的天然饵料及养殖等方面具有较好运用前景[5-7]；部分摇蚊为农业害虫，不仅危害莲藕，还会捕食仔鱼，并传播疾病[8]。因此，对摇蚊的系统研究、环境评价、水产品养殖等方面具有重要意义。为此，2020年4月笔者在云南省双江县采集摇蚊，采用形态学和分子生物学方法对采集到的4种摇蚊进行了鉴定，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集及初步分类

2020年4月23日18:00至次日8：00在云南省双江县布京村大勐峨组一黄牛养殖场牛圈内采用灯诱方法(功夫小帅，12V， 300mA， 湖北武汉)进行昆虫标本采集[9]。将采集到的标本放入-20℃冰箱中冷冻致昆虫死亡，在体视显微镜下挑选出摇蚊，并根据形态特征对摇蚊进行初步鉴定，并进行计数，不同形态摇蚊标本放入1.5mL离心管加入1mL 70%乙醇浸泡，编号，4℃保存。

1.2 摇蚊形态学鉴定

从离心管中取出摇蚊标本，切下昆虫翅膀，在光学显微镜下观察昆虫形态学特征。虫体加入200μL消化液，40℃金属浴放置过夜[10]。

1.3 DNA提取及PCR扩增

用DNA提取试剂盒(天根公司)按说明书从上述消化液中提取摇蚊基因组DNA，取2μL 摇蚊基因组DNA做模板，依次加入2.5μL 10×Buffer、2μL 2.5mmol/L dNTP、0.5μL COI基因上游引物[11]、0.5μL COI基因下游引物[11]、9.5μL 去离子水，参照文献方法进行PCR扩增。1%琼脂糖电泳检查扩增条带，PCR扩增阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司(昆明测序部)进行测序。

1.4 序列分析

分别使用DNA Star软件中SeqMan和MegAlign进行序列拼接和核苷酸同源性分析。使用MEGA X 软件构建最大似然法(ML)系统进化树，筛选DNA最佳模型，bootstrap值为1000。

2 结果

2.1 摇蚊采集

2020年4月23日在云南省双江县布京村大勐峨组黄牛养殖场采集到摇蚊160只，其中雌摇蚊151只(94.4%)、雄摇蚊9只(5.6%)。

2.2 形态学鉴定

采集的160只摇蚊身体黑色，翅膀上均有明显的淡色和暗色斑块，按翅膀上淡斑和暗斑的形态、大小、位置，把采集到的160只摇蚊分为4类，第一类(以SJ2为代表)翅面有4个大小不等、不规则、明显的暗斑(见图1 A)，第1个暗斑较大，位于中1室靠近基部1/4处，暗斑下缘超过中2脉；第2个暗斑较小，位于中2室中部，暗斑下缘不超过中3+4脉；第3个暗斑成矩形，覆盖中肘叉并超过肘1脉抵达翅下缘；第4个暗斑上缘覆盖肘2脉，向下覆盖臀室中部，但下缘未抵达翅下缘。 第二类(以SJ26为代表)翅面有4个大小不等、不规则、明显的暗斑(见图1 B)，第1个、第3个暗斑位置大小形态与SJ2相似；第4个暗斑位置与SJ2相似，但形态与SJ2有明显区别，呈不规则形；第2个暗斑为长条形，上缘起于中1脉，暗斑前端开始于靠近基部2/10处向后到达7/10处，暗斑下缘与中3+4脉形成一白色条带。第三类(以SJ22为代表)翅面有4个大小不等、不规则、明显的暗斑(见图1 C)，第1个、第3个和第4个暗斑位置大小形态与SJ2相似；第2个暗斑位置与SJ2相似，但比SJ2大，暗斑端部明显，靠近基部有点模糊。第四类(以SJ24为代表)翅面有5个大小不等、不规则、明显的暗斑(见图1 D)，第1个、第2个、第3个和第4个暗斑位置大小形态与SJ26相似，但在中1室端部还存有一个颜色较浅的暗斑。

A.SJ2；B.SJ26；C.SJ22；D.SJ24。

2.3 摇蚊分子鉴定

2.3.1核苷酸同源性分析

分别选取双江县采集到的不同形态的11只摇蚊(编号分别为SJ1、SJ2、SJ3、SJ19、SJ20、SJ21、SJ22、SJ23、SJ24、SJ25、SJ26)进行昆虫COI基因扩增，序列测定分别获得每只摇蚊437个核苷酸(nt)序列。同源性分析结果显示，双江县采集的11只摇蚊COI基因核苷酸同源性在84%～100%，其中SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只摇蚊COI基因核苷酸同源性在99.3%～100%，而与其他5只摇蚊核苷酸同源性均低于86%；SJ21和SJ22两只摇蚊核苷酸同源性为97.7%，而与其他9只摇蚊核苷酸同源性均低于87%；SJ25和SJ26两只摇蚊核苷酸同源性为99.8%，而与其他9只摇蚊核苷酸同源性均低于90.2%；SJ2与SJ25和SJ26核苷酸同源性最高仅为89.9%～90.2%，而与其他8只摇蚊核苷酸同源性均低于87%。11只摇蚊COI基因核苷酸与GenBank中20种27条已知摇蚊相应序列一起进行分析(见表1)，SJ2与2013年在云南省勐海县采集的、2011年在浙江衢州采集的以及2013年在日本茨城采集的P.japonicum核苷酸同源性最高在91.5%～99.5%，而与其他摇蚊核苷酸同源性均在90.6%以下；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只摇蚊与2014年在云南省勐腊县采集的Polypedilumsp3 SC(KU497064)核苷酸同源性最高在99.3%～100%，而与其他已发现摇蚊核苷酸同源性均低于89%；SJ21和SJ22两只摇蚊与2013年云南省勐海县采集的Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)和Polypedilumsp2 SC (KU497059)摇蚊核苷酸同源性最高在97.3%～99.5%，其次与2015年在广西河池采集的Polypedilumsp2 SC (KU497090)较高核苷酸同源性最高在92.7%～94.1%，而与其他摇蚊核苷酸同源性均在89.7%以下； SJ25和SJ26两只摇蚊与2013年在云南省勐海县采集的P.scalaenum核苷酸同源性最高在97.3%～97.9%，而与其他摇蚊核苷酸同源性均低于90.6%。

表1 云南省双江县4种摇蚊COI基因核苷酸序列同源性分析

2.3.2COI基因系统进化分析

将11只摇蚊COI基因与GenBank 中不同摇蚊种类相应基因27条序列一起构建ML系统进化树，选用GTL+G+I模型为最佳DNA模型，在系统进化树上双江县采集的11只摇蚊与选用的22条多足摇蚊属(Polypedilum)摇蚊位于同一较大的进化分支内，提示本次在双江县采集到的摇蚊均为多足摇蚊属摇蚊。进一步分析发现本次双江县采集的11只多足摇蚊属摇蚊分别位于4个进化分支内， SJ2与4条P.japonicum序列形成同一进化分支；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只摇蚊与Polypedilumsp3 SC(KU497064)摇蚊序列形成同一进化分支；SJ21和SJ22两只摇蚊与Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)、Polypedilumsp2 SC (KU497059)和Polypedilumsp2 SC (KU497090)摇蚊序列形成同一进化分支；SJ25和SJ26两只摇蚊与P.scalaenum摇蚊序列形成同一进化分支(见图2)。以上分析结果提示SJ2摇蚊可能是P.japonicum，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只摇蚊可能是与Polypedilumsp3 SC(KU497064)相同种类的摇蚊，SJ21和SJ22两只摇蚊是与Polypedilumsp2 SC(KU497084、KU497066、KU497059) 相同种类的摇蚊，SJ25和SJ26两只摇蚊可能是P.scalaenum摇蚊。

2.4 分类鉴定结果

采用形态学和分子生物学方法明确采集摇蚊种类后，对采集到的160只摇蚊进行分类(见表2)，结果显示存在4种多足摇蚊属摇蚊，其中多足摇蚊属Polypedilumsp3 SC摇蚊为优势种，占全部采集摇蚊数量的81.25%；其次为与Polypedilumsp2 SC(KU497084)种类相似的多足摇蚊属摇蚊，占全部采集摇蚊数量的11.25%，P.japonicum和P.scalaenum两种摇蚊数量较少，仅占全部采集摇蚊数量的7.5%。

采用最大似然法(ML)构建系统进化树，最佳模型选用(GTR+G+I)；圆点代表本次采集到摇蚊标本。

表2 云南省双江县黄牛养殖场摇蚊种群构成

3 讨论

本研究在双江县采集到的摇蚊翅面上均有明显的淡、暗斑，根据暗斑数量、形态、位置、大小分为4类，同样COI基因序列分析结果也显示了翅面上形态学上不同的4类摇蚊也分别位于不同的4个进化分支内，提示本次在双江县采集的摇蚊可能为4个不同的种类。进一步分析结果显示SJ2与P.japonicum遗传进化关系密切，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只摇蚊与Polypedilumsp3 SC遗传进化关系密切，SJ21和SJ22两只摇蚊与Polypedilumsp2 SC遗传进化关系密切，而SJ25和SJ26两只摇蚊与P.scalaenum遗传进化关系密切，提示云南省双江县存在P.japonicum、Polypedilumsp3 SC、Polypedilumsp2 SC和P.scalaenum等4种多足摇蚊属摇蚊。

本次双江县采集到的4种多足摇蚊属摇蚊，除P.japonicum翅面有5个暗斑外，P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum均有4个暗斑，中1室、中肘叉-肘1脉、臀室暗斑形态、位置相似，仅靠这3个暗斑难于区分，这3种多足摇蚊属摇蚊主要依据中2室暗斑大小、位置、形态的不同来进行区分。因此，中2室暗斑是形态学鉴定P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum等摇蚊种类的重要特征。

目前，在世界上已经发现了8个亚属520种多足摇蚊属(PolypedilumKieffer，1912)摇蚊，该属摇蚊地理分布范围非常广泛[12]。在中国目前已经发现多足摇蚊属摇蚊大约90种[13]。近年来，在云南省西双版纳州勐海县和勐腊县以及保山市高黎贡山等地区的调查中共发现了P.japonicum、P.scalaenum、P.tsukubaense、P.xianjuensis、P.asakawaense、P.nubifer、P.yongsanensis、P.genpeiense、P.cochlearum、P.spathum、P.decematoguttatum、P.heberti、P.cf.okigrandis、P.cf.alticola、P.bingoparadoxum、P. 8SC、P.sp4SC、P. 6SC、P.sp5SC、P.sp2SC、P.sp3 SC等21种多足摇蚊属摇蚊[12,14]。本研究再次在云南省临沧市双江县布京村大勐峨组黄牛养殖场采集到了P.japonicum、P.scalaenum、P.sp3 SC 、P.sp2 SC等4种多足摇蚊属摇蚊，表明了这几种多足摇蚊属摇蚊在云南省南部边境地区分布较为广泛。

双江县位于云南省西南部，气温较高，气候湿润，植被较好，有利于多种昆虫存在和繁殖。摇蚊与蠓虫外形相似，常常被误认为不吸血蠓虫[12]。本次研究在双江县大勐峨村黄牛养殖场采集蠓虫中，同时采集到一些体型相似、翅面上具有淡暗斑的昆虫，经形态学和分子生物学鉴定为4种多足摇蚊属摇蚊。该研究不仅丰富了我国摇蚊种类资源，也对摇蚊生态学、水产品天然饵料及养殖、水体污染、农业危害等方面进一步的研究具有重要意义。