三七总皂苷对斑马鱼胚胎初级和次级造血的抑制作用

孙一涵，毛爱华，王强

(1. 中国科学院动物研究所，膜生物学国家重点实验室，北京 100101； 2. 河北省安国中学，河北 保定 071200)

造血干细胞是一群维持生命体正常生理功能所必需的多能造血祖细胞，随着发育进行，可以生成各种成熟的血细胞，包括：红细胞、髓系细胞和淋巴细胞等。造血作用指造血祖细胞经过增殖、分化最终形成成熟的血细胞过程。脊椎动物胚胎造血在进化上高度保守，斑马鱼和哺乳动物胚胎造血类似，根据造血的时间和位置以及生成细胞的特征，可分为初级造血(primitive hematopoiesis)和次级造血(definitive hematopoiesis)两个阶段[1]。在斑马鱼胚胎中，初级造血中心大约形成于胚胎受精后18 hpf (hours post-fertilization)，位于胚胎脊索腹侧躯干区域的中间细胞团(intermediate cell mass，ICM)。斑马鱼胚胎的中间细胞团类似于哺乳动物的卵黄囊，能够产生造血干细胞、红细胞前体细胞等。这些细胞随着血液循环的开始进入循环体系，生成红细胞，为胚胎发育提供氧气和营养物质。斑马鱼次级造血过程与哺乳动物类似，其起源也与哺乳动物类似，均起始于主动脉腹侧壁，也称为主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros，AGM)区域，产生造血干细胞并分化为各种成熟的血细胞[2]。因此，以斑马鱼研究造血发育以及药物筛选所获得的发现和结论，对于研究哺乳类甚至人类的造血作用都具有十分重要的借鉴作用。

三七是我国名贵中药，属于五加科人参属。三七的根茎和花均可用药，三七根中提取的有效活性成分是三七总皂苷(Panax notoginsenosides，PNSs)，主要包括三七皂苷、黄酮、蛋白氨基酸及非蛋白的多糖、甾醇等成分[3]。三七总皂苷具有良好的止血、活血化瘀、消炎止痛等功效，近年来也用作心血管疾病的药物，用于治疗冠心病、心律失常等[4-5]。目前关于PNSs的药理学研究主要针对成体小鼠模型以及体外培养的细胞系[6-8]。关于PNSs是否影响胚胎造血作用，目前并不清楚。因此，本文以斑马鱼胚胎为研究对象，用不同浓度的PNSs处理，观察是否影响斑马鱼胚胎造血发育，为三七的药理学应用和价值开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验所用的野生型斑马鱼(Daniorerio)为Tuebingen品系，斑马鱼胚胎用含Holfreter水(0.05 g/L KCl, 0.1 g/L CaCl2, 0.2 g/L NaHCO3, 3.5 g/L NaCl)的培养皿于28.5℃恒温培养箱培养。

1.1.2 试剂与仪器

三七粉(河北康派中药材有限公司)，联甲氧基苯胺(O-dianisidine)，冷冻离心机，激光共聚焦显微镜。

1.2 方法

1.2.1 三七总皂苷提取

本实验采用乙醇提取法获得PNSs，方法参照文献[9]。准确称取4 g三七粉，置于100 mL的锥形瓶中，加入40 mL 70%乙醇，采用热回流提取 3 次，每次 30 min。然后合并所获得的上清，蒸发浓缩至一定体积，通过冷冻离心干燥，获得1.23 g干粉，得率为30.75%。用DMSO溶解这些粉末，配成100 mg/mL的母液，-20℃保存，备用。

1.2.2 药物浓度的确定

用Holfreter水稀释PNSs母液，设置4个浓度梯度，依次为25、50、100、250 μg/mL。对照组胚胎用含0.25%的DMSO 的Holfreter水培养。将受精后发育至75%外包的胚胎置于6孔板内，每孔放入约40枚胚胎，观察受精后24 h胚胎的发育情况，统计胚胎延迟发育和死亡率。

1.2.3 斑马鱼胚胎处理

收集受精后发育至75%外包的胚胎置于六孔板，按照(1.2.2)中探究好的PNSs浓度梯度给药处理，28.5℃恒温培养箱遮光培养。每隔12 h更换药物，然后置于培养箱继续培养。收集发育至相应时期的胚胎，用于原位杂交、O-dianisidine (联甲氧基苯胺)染色以及活体拍照等。

1.2.4 斑马鱼整胚原位杂交

整胚原位杂交中所用探针采用Roche公司生产的地高辛(DIG) 标记，探针的合成参考说明书。原位杂交所需要的试剂及其配制方法和具体的操作步骤参照文献[10]。

1.2.5 联甲氧基苯胺染色

联甲氧基苯胺能够特异性的标记红细胞中的血红蛋白。通过联甲氧基苯胺染色可以检测斑马鱼胚胎中血红蛋白的表达，从而验证PNSs在造血过程中对红细胞生成的作用。实验试剂的配制和实验方法参照文献[11]，收集发育至48 hpf的胚胎，脱膜后用 Holfreter 水重复洗两次。吸去 Holfreter水，加入联甲氧基苯胺染液室温下遮光染色。

2 结果

2.1 药物浓度确定

为了探索PNSs作用于斑马鱼胚胎的最佳实验浓度，我们进行了浓度梯度实验。收集受精后发育至75%外包的胚胎，分成五组，分别为DMSO处理的对照组和25、50、100、250 μg/mL的PNSs处理组。待胚胎发育至受精后24 h，观察胚胎发育情况。结果如图1A所示，低浓度的PNSs处理后，对胚胎形态无明显影响；但是当浓度达到250 μg/mL，大部分胚胎发育明显滞后或卵黄发黑死亡。如图1B所示，统计分析三次独立实验，25 μg/mL至100 μg/mL PNSs处理组，胚胎几乎发育正常，而250 μg/mL处理组，60%以上的胚胎发育受阻或者死亡。因此后续实验主要选择25、50和100 μg/mL浓度梯度进行处理，研究PNSs对斑马鱼胚胎造血发育的影响。

注：A. 用不同浓度的PNSs从75%外包开始处理斑马鱼胚胎，观察发育至受精后24 h的胚胎形态；B. 统计学分析不同浓度梯度处理后斑马鱼胚胎发育延迟或者死亡率。统计数据来自三次生物学重复。图1 不同浓度的PNSs对斑马鱼胚胎发育的影响Note. A. Zebrafish embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and embryo morphology was observed at 24 hpf. B. After treatment of zebrafish with different concentration of PNSs, embryonic development delay or mortality rate was statistically analyzed. All measurements were performed in triplicate.Figure 1 Effects of different concentrations of PNSs on the embryonic development of zebrafish

2.2 PNSs处理导致造斑马鱼初级造血缺陷

通过摸索三七总皂苷浓度梯度，我们确定了以25、50、100 μg/mL浓度的PNSs梯度处理斑马鱼胚胎，没有明显的毒副作用。因此，我们分别用25、50、100 μg/mL的PNSs，从75%外包开始处理胚胎，待其发育至受精22 h后，通过整胚原位杂交技术检测初级造血红细胞特异性标记基因gata1和hbbe3在ICM区的表达。与对照组相比，25 μg/mL处理组胚胎gata1和hbbe3的表达均略有减少，而50和100 μg/mL处理组的胚胎gata1和hbbe3的表达均明显降低(图2A和2B)。这些结果说明PNSs处理抑制了斑马鱼胚胎的初级造血发育。由于50和100 μg/mL 的PNSs抑制效果比较明显，后续实验均采用这两个浓度梯度处理胚胎。

为了进一步确认PNSs对斑马鱼初级造血的影响，我们通过联甲氧基苯胺染色实验检测了受精后48 h的斑马鱼胚胎中红细胞的生成情况。与对照组相比，50和100 μg/mL PNSs处理的胚胎红细胞明显减少，且100 μg/mL处理组的胚胎抑制效果更显著(图2C)。这些结果证明，PNSs对斑马鱼胚胎初级造血发育有抑制作用，而且其浓度越高，抑制作用越明显。

注：A-B. 不同浓度PNSs从75%外包开始处理胚胎，在受精后22 h检测初级造血的分子标记基因gata1和hbbe3的表达；C. 联甲氧基苯胺染色检测受精后48 h的斑马鱼胚胎中红细胞的发育。图2 PNSs抑制斑马鱼胚胎初级造血Note. A-B. Embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and the expression of primitive hematopoietic marker genes gata1 and hbbe3 were detected at 22 hpf. C. O-Dianisidine staining was used to detect the development of erythrocytes of 48 hpf zebrafish embryos.Figure 2 PNSs inhibited the primitive hematopoiesis of zebrafish embryos

注：A-B. 不同浓度PNSs从75%外包开始处理胚胎，在受精后26 h (A) 和36 h (B)通过原位杂交检测斑马鱼胚胎造血干细胞的分子标记runx1和cmyb的表达。图3 PNSs抑制斑马鱼的造血干细胞生成Note. A-B. Embryos were treated with different concentrations of PNSs from 75% epiboly stage, and the expressions of molecular marker genes runx1 and cmyb in zebrafish embryo hematopoietic stem cells were detected by in situ hybridization at 26 hpf (A) and 36 hpf (B).Figure 3 PNSs inhibited the zebrafish hematopoietic stem cells

2.3 PNSs影响造血干细胞生成

在斑马鱼胚胎受精后24 h，位于AGM区域主动脉腹侧壁的生血内皮通过内皮-造血转化过程产生造血干细胞，继而起始次级造血。为了探讨PNSs对胚胎次级造血的影响，我们检测了造血干细胞的分子标记runx1和cmyb的表达。与对照组相比，在受精后26 h，50 μg/mL PNSs处理的胚胎，runx1和cmyb均无明显变化，但是100 μg/mL处理显著抑制runx1和cmyb表达(图3A)，说明在造血干细胞产生初期，PNSs就已经对次级造血产生影响。当胚胎发育至36 hpf时，高浓度PNSs的抑制作用更加明显，runx1和cmyb的表达均显著下调(图3B)。这些结果表明，PNSs处理抑制斑马鱼胚胎次级造血。

2.4 PNSs影响T细胞生成

在斑马鱼中，造血干细胞在 AGM 出现后，迁移至尾部造血组织进行增殖扩张。部分造血干细胞迁移至胸腺后分化为T淋巴细胞。因此通过检测胸腺内 T淋巴细胞的生成可以反映造血干细胞发育。我们检测了T淋巴细胞标记基因rag1 的表达，发现处理组胚胎rag1几乎不表达(图4)。这些结果同样证明，PNSs对胚胎的次级造血具有较强的抑制作用。

2.5 PNSs对胚胎血管形成没有明显影响

我们观察到PNSs处理后导致造血干细胞生成明显减少。由于HSC来源于AGM 区主动脉腹侧壁的内皮细胞，我们猜想造血干细胞发育缺陷可能与主动脉血管发育受阻相关。因此，接下来我们观察了特异性标记血管内皮细胞的转基因品系Tg(kdrl:eGFP)胚胎在36 hpf AGM区血管的发育情况。与我们的推测不同，50和100 μg/mL PNSs处理的胚胎血管形成并未发生明显变化(图5)。因此，PNSs并不是通过影响血管的发育而间接抑制造血干细胞生成。

注：不同浓度PNSs处理胚胎后，原位杂交检测受精后第3天T淋巴细胞分子标记rag1的表达。图4 PNSs抑制T淋巴细胞生成Note. After treatment of the embryos with different concentrations of PNSs, the expression of T lymphocyte molecular marker rag1 was detected by in situ hybridization at 3 dpf.Figure 4 PNSs inhibit the T lymphocyte formation

图5 活体观察不同浓度PNSs处理胚胎后36 hpf AGM区血管结构(比例尺：200 μm)Figure 5 Vascular structure of AGM region of the 36 hpf embryos was observed in vivo after treatment with different concentrations of PNSs(Scale bar=200 μm)

3 讨论

近年来，利用斑马鱼作为模式生物探讨中药的临床功能的相关研究越来越多，对中药的开发利用、中药有效成分的筛选以及中药作用机制的阐明具有巨大的促进作用[12]。本文以斑马鱼为动物模型来研究PNSs对胚胎造血的影响。实验结果表明，PNSs对斑马鱼胚胎初级造血和次级造血均有抑制作用，且这种抑制效果具有浓度依赖性。通过活体观察，我们发现50和100 μg/mL PNSs处理胚胎，整体发育并没有受到明显影响，但是红细胞的生成受到严重抑制，说明初级造血受到影响。然而，PNSs影响初级造血的具体分子机制还需进一步探讨。

在AGM区检测HSC的分子标记runx1和cmyb，低浓度的PNSs处理后并没有明显变化，但浓度达到100 μg/mL时，次级造血在起始阶段就有缺陷，造血干细胞生成减少，而且胸腺中HSC分化产生的T淋巴细胞也受到抑制。PNSs处理的胚胎血管发育正常，说明PNSs可能通过影响动脉内皮向HSC转化而直接调控造血干细胞生成，而不是通过影响血管发育而间接抑制次级造血。

在体外实验中，PNSs具有生血功能，调控与造血细胞增殖、分化相关基因的表达[13]。本研究通过用PNSs处理斑马鱼胚胎，发现PNSs对胚胎期造血发育具有抑制作用，为三七药物的合理有效使用提供了实验依据。我们的结果提示，在孕期可能需要慎重使用三七总皂苷药物。