重组CC16蛋白对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织结构及MMP-9和TIMP-1表达的影响

房晨阳，周霞，杨艳珍，梁李娟，庞敏*，王文桃，孙佳，刘宏延，王海龙

(山西医科大学： 1. 第一医院呼吸科； 2. 基础医学院， 太原 030001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续性气流受限为特征的呼吸系统疾病，病理变化表现为由慢性炎症引起的呼吸道损伤，破坏肺部结构，引起气道重塑[1]。临床主要应用支气管扩张剂、激素抗炎剂、抗氧化剂等进行对症治疗，难以改善肺功能，远期疗效较差。克拉拉细胞蛋白16(club cell protein 16，CC16)主要由位于气道上皮的club细胞分泌合成，具有抗炎和免疫调节活性[2]。研究发现，气道CC16蛋白质含量的减少，是引起慢性阻塞性肺疾病发生发展的重要因素之一[3]，而给予CC16蛋白质被视为干预肺部炎症性疾病的一种措施[4]。本文在前期获得重组大鼠CC16蛋白质(rCC16)且确定其安全剂量的基础上[5-6]，研究CC16对香烟烟雾(cigarette smoke，CS)联合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制备的COPD小鼠肺组织病理改变及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue Inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级C57BL/6 小鼠40 只，8 周龄，体重为18 ～ 20 g，由山西医科大学实验动物中心提供【SCXK(晋)2010-0002】，符合国家及国际动物伦理学标准。小鼠饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境中【SYXK(晋)2015-0001】，并按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀，且所有实验操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC2014-16)。

1.1.2 试剂与仪器

芙蓉牌过滤嘴香烟(焦油量 12 mg；烟碱量 1.0 mg，烟气CO量 14 mg)；TRIzol、RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq Kit(大连宝生物科技有限公司，中国)； BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)，兔抗小鼠MMP-9多克隆抗体、兔抗小鼠TIMP-1多克隆抗体、SABC免疫组织化学检测试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司，中国)，其余试剂为国产分析纯。自制熏烟箱(有机玻璃，长宽高分别为80 cm × 80 cm × 80 cm)； BX 41TF 型光学显微镜(日本电子株式会社)；PikoREAL实时定量荧光PCR仪(Thermo Scientific公司，美国)；UV-2602型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司，中国)；QWin图象分析软件(Leica公司，德国)，Tanon 2500 天能凝胶成像系统(上海天能科技有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 重组大鼠CC16蛋白质的制备

参照文献[5]和[6]的方法制备并纯化重组大鼠CC16蛋白质(rCC16)。蛋白质定量后溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，制备成2 μg/μL于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 实验分组及COPD 模型建立

将40 只小鼠随机均分为空白组、COPD 模型组、rCC16 剂量组1(1 μg/g体重)和rCC16剂量组2(2.5 μg/g体重)。除空白组不进行COPD 模型制备外，其余小鼠均采用香烟烟雾吸入法制作COPD 稳定期小鼠模型。将除空白组外的各组小鼠(共30只)分别置于熏烟箱中进行人为被动吸烟，每日吸入烟雾2次(上午1次、下午1次)，每次使用12支，时间大致为60 min，每个星期6 d，整个熏烟持续12 周。在熏烟期间，持续监测熏烟箱内O2含量，保证其始终在19.2% ～ 20.5% 范围之内(如氧浓度低于标准，停止香烟燃烧，仅泵入空气)。rCC16 干预组大鼠于吸烟第3月开始，应用不同剂量 rCC16 对吸烟小鼠进行滴鼻干预。rCC16 剂量组1(1 μg/g体重)和rCC16剂量组2(2.5 μg/g体重)，每次20 μL，每日1次。空白组和COPD组则用等量的PBS来替代，持续干预4周。滴鼻操作由固定人员完成，操作前先抚摸小鼠，增进熟悉，减少小鼠紧张；将20 μL滴鼻液吸入吉尔森 P20微量移液器(2 ～ 20 μL)，左手固定小鼠，右手持移液器进行滴鼻。为减轻小鼠的不适感，滴鼻在两个鼻孔间隔进行，1 只小鼠的滴鼻操作在3 min完成。

1.2.3 一般行为观察

观察各小鼠精神状态、饮食情况、体重变化及大小便情况等。

1.2.4 小鼠肺组织形态学观察

小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(100 mg/kg体重)进行麻醉，腹主动脉取血后，打开胸腔，暴露双肺，将右肺部取下，放入 4%甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片(4 μm 厚)，行常规H&E染色，显微镜下分析各组小鼠肺组织形态结构变化。

1.2.5 Real-time PCR检测小鼠肺组织MMP-9，TIMP-1 mRNA的表达

小鼠麻醉后，将左肺取出，迅速置于液氮中进行研磨，加入 1 mL Trizol裂解液，按说明书提取各组组织总RNA，紫外分光光度计测量浓度后取1 μg按照试剂盒说明书进行逆转录及PCR扩增。qPCR的引物及扩增条件参照已发文章[7]，具体为94℃ 5 min，接着94℃ 30 s、58℃ 30 s，70℃ 45 s，40个循环，将目的基因的Ct用大鼠GAPDH的Ct值进行标准化，基因表达的相对倍数变化用比较阈值法(即2-△△CT)表示。此外，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步检测。小鼠MMP-9的上游引物序列为5’- CGTCGTGATCCCCACTTACT -3’，下游引物序列为5’- AACACACAGGGTTTGCCTTC -3’；TIMP-1的上游引物序列为5’- CATGGAAAGCCTCTGTGGAT -3’，下游引物序列为5’- CTCAGAGTACGCC AGGGAAC -3’；β-actin(β-肌动蛋白)的上游引物序列为5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG -3’，下游引物序列为5’- ACCAGAGGCATACAGGGACA -3’，引物由北京(中美)泰和生物技术有限公司合成。

1.2.6 免疫组织化学检测小鼠肺组织MMP-9，TIMP-1 蛋白质的表达

严格按照SABC试剂盒说明书操作，切片脱蜡至水，微波修复，洗涤，滴加山羊血清封闭，滴加一抗(MMP-9，1∶100; TIMP-1，1∶100) 4℃ 过夜孵育，第2天PBS洗涤，滴加二抗(1∶500)，PBS洗涤，DAB 显色，流水冲洗，苏木精复染，流水冲洗，脱水，树胶封片。每只小鼠的组化切片选取3个视野，镜下观察(×200)。用Leica图像分析系统对每组MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平进行分析处理，胞质中的棕色颗粒为阳性表达，表达水平用灰度值来表示，灰度值越高，表达强度越小。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般行为观察

空白组小鼠活泼好动，皮毛柔顺有光泽，饮食摄水正常，体重随饲养周期增大。模型组小鼠皮毛枯槁无光泽，撮毛，行动迟缓，呼吸急促，进食进水量减少，体重较空白组明显减轻, 差异有显著性(n=10，P< 0.05)。rCC16干预组1和干预组2小鼠体型偏瘦，活动较自如，皮毛欠润泽，气促不明显，体重较模型组增加，以干预组2增加明显。与模型组比较，干预组2在干预后第3周开始体重明显增加，而rCC16干预组1在第4周体重才开始增加，差异有显著性(n=10，P< 0.05)(图1)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与COPD组比较，#P<0.05，▲P<0.05。(下图同)图1 各组小鼠在rCC16处理前后体重变化Note.* P< 0.05, vs control group;# P< 0.05,▲ P< 0.05, vs COPD group.(The same in the following figures)Figure 1 Body weight of the mice in different groups before or after rCC16 treatment

2.2 rCC16干预可以减轻COPD小鼠的肺部损伤

病理学观察结果显示空白组小鼠肺组织正常，呼吸道及肺泡结构正常，无代偿性肺气肿形成，肺泡腔未见炎症细胞(图2A)。COPD模型组小鼠肺泡的结构出现明显的破坏，肺泡间隔增宽，部分肺泡壁断裂融合形成肺泡气肿，代偿性肺气肿形成，血管及支气管炎症细胞浸润(图2B)。1 μg/g体重 rCC16干预后，小鼠仍然有肺大泡的形成，但较之COPD组明显减少，且炎性细胞浸润也有所改善(图2C)。2.5 μg/g体重 rCC16干预后炎性细胞浸润明显减少，肺大泡的形成也明显减少，肺泡结构趋于完整(图2D)。

2.3 rCC16干预减少COPD小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1的表达

RT-qPCR结果显示，与正常组小鼠比较，COPD组小鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的mRNA表达量显著增加，表达差异有显著性(n=10，P< 0.01)，rCC16干预组1可以降低MMP-9和TIMP-1的mRNA表达，表达差异有显著性(n=10，P< 0.05)，而rCC16干预组2对MMP-9 mRNA的降低作用更明显，表达差异有显著性(n=10，P< 0.01)，但对TIMP-1 mRNA表达的降低作用与rCC16干预组1比较，差异无显著性表达(图3)。与mRNA表达结果一致，免疫组化结果显示，肺组织中MMP-9和TIMP-1蛋白质主要表达于气道上皮细胞胞质中，与正常组小鼠比较，COPD组小鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1蛋白质表达量显著增加，表达差异有显著性(n=10，P< 0.01)，rCC16干预后可以显著降低MMP-9和TIMP-1 蛋白的表达，表达差异有显著性(n=10，P< 0.01)，我们还发现，rCC16对小鼠肺组织中MMP-9的表达有剂量依赖性，而对TIMP-1 表达的降低作用没有剂量依赖关系(图4-5)。

图2 各组小鼠肺组织病理学改变(H&E染色，×200)Figure 2 Histological changes of the lung tissues in mice of different groups(H&E staining, ×200)

注：A: MMP-9 mRNA相对表达量；B: TIMP-1 mRNA相对表达量；C: RT-qPCR扩增MMP-9、TIMP-1产物琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA Marker,1～4分别为对照组、COPD模型组、rCC16剂量组1和rCC16剂量组2的PCR产物。图3 RT-qPCR检测rCC16对香烟诱导小鼠COPD模型肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响Note. A: Relative mRNA expression of MMP-9. B: Relative mRNA expression of TIMP-1. C: Agarose gel electrophoresis of MMP-9 and TIMP-1 RT-qPCR amplification products. M: DNA Marker, 1 ～ 4: PCR products of the control group, COPD group, rCC16 treatment 1 group and rCC16 treatment 2 group, respectively. Figure 3 RT-qPCR detection of the effect of rCC16 on the mRNA expressions of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of the cigarette-induced mouse COPD models

图4 免疫组织化学法检测rCC16对香烟诱导小鼠COPD模型肺组织MMP-9(A-D)及TIMP-1(E-H)表达的影响 (×400)Figure 4 Immunohistochemical detection of the effect of rCC16 on protein expression of MMP-9 (A-D) and TIMP-1(E-H) in lung tissue of the cigarette-induced mouse COPD models (×400)

注：A: MMP-9阳性细胞平均灰度值; B: TIMP-1阳性细胞平均灰度值。图5 各组小鼠肺组织MMP-9和TIMP-1 免疫组化阳性表达灰度分析Note. A: The average gray value of MMP-9 positive cells. B: The average gray value of TIMP-1 positive cells.Figure 5 Gray analysis of positive expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of mice in different groups

3 讨论

目前，COPD居全球病死原因第4位，且随着工业化进程的推进，造成空气污染(如雾霾)的频发，导致COPD的发病率及死亡率逐年上升，世界卫生组织估计，至2020 年COPD 将位居世界疾病经济负担的第5位，全球病死原因的第3位[8]。COPD的临床特点主要为慢性炎症反应所引起的呼吸道的损伤。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)又称为明胶酶，主要由巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞分泌，能够降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，破坏肺部结构，参与气道重塑。临床实验发现在COPD 患者的痰液和支气管灌洗液中MMP-9的含量明显增高[9]。TIMP也是由巨噬细胞、内皮细胞分泌，可以特异性的抑制基质金属蛋白酶的活性。TIMP-1和MMP-9以一定的比例(1∶1)形成聚合体，从而使酶的活性降低[10]。两者之间的动态平衡是维持ECM的关键，是呼吸道和肺部损伤及修复的标志[11]。

克拉拉细胞沿气道对称分布的无纤毛柱状上皮细胞，CC16是其主要的合成并分泌的蛋白质。该蛋白质具有抗炎和免疫调节功能，在肺部炎症性疾病的发生发展中具有重要作用[2]。我们前期的体外研究显示，rCC16蛋白质可以降低脂多糖诱导的大鼠气道上皮细胞中MMP-9的表达[6]。组成大鼠和小鼠CC16蛋白质的氨基酸具有89.58%的一致性，rCC16可以作用于小鼠来源的巨噬细胞，减少由脂多糖诱导的炎性因子肿瘤坏死因子、白细胞介素-6和白细胞介素-8[12-13]。此外，被动吸烟还可导致实验动物如大鼠气道上皮Clara细胞及其分泌蛋白(CC16)的减少[14]。然而，rCC16干预能否减轻COPD实验动物模型中肺组织的损伤及对MMP-9的表达有所影响还未见研究。本实验采用被动吸烟法成功构建了小鼠COPD模型，应用rCC16进行滴鼻干预治疗。研究结果显示COPD组的小鼠肺泡的完整性出现了明显的破坏，融合形成较大的肺泡， rCC16干预后，上述表现有所改善，且高剂量组较低剂量组的作用明显，即具有剂量依赖关系。进一步我们分析了肺组织MMP-9和TIMP-1的表达，RT-PCR和免疫组化均显示rCC16可以降低COPD组小鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1的表达。有趣的是rCC16对MMP-9和TIMP-1表达的抑制作用主要体现在气道上皮细胞，而对肺泡上皮细胞中二者的表达则没有影响，且rCC16对MMP-9的调节具有剂量依赖性，而对TIMP-1的调节并不具有剂量依赖关系，这可能是因为气道上皮细胞通过网格蛋白介导的内吞作用将rCC16摄取后调控核转录因子-ΚB的转录活性而直接影响MMP-9的表达[6, 15]，而rCC16调节TIMP-1的具体机制还需进一步研究。

CC16作为药物具有诸多优点，如体积小、易通过人工重组获得、对酶、温度、酸碱等变化的稳定性好，这些特点成为临床用药的巨大优势。前期的研究证明大鼠CC16蛋白质能够降低脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)炎症反应[12]，表明其生物学活性不仅仅局限于大鼠，但该研究仅为体外实验。COPD动物模型的建立主要有空气污染(特别是二氧化硫)、被动吸烟和呼吸道感染(主要是细菌)等[16]。本文在研究中选用小鼠被动吸烟法制备COPD模型，就是要在体内实验的基础上进一步证实大鼠rCC16蛋白质的生物学活性。我们的实验表明，重组CC16蛋白质可以减轻COPD小鼠肺组织损伤，通过影响MMP-9和TIMP-1的表达来改善肺组织的气道重塑，为CC16在临床作为干预气道炎症疾病的应用提供了实验依据。