亚甲蓝与七氟醚在肺缺血再灌注(IR)损伤大鼠模型中对血清及肺组织氧化应激指标及炎症因子的影响

李佳岑，罗 瑶，曾 思

(四川省医学科学院，四川省人民医院麻醉科， 成都 610041)

缺血再灌注是机体器官暂时性血流供应不足后再次恢复血流灌注时产生的病理过程，如氧化应激、异常炎症、凋亡坏死等，尽管缺血后恢复血流供应，但是组织器官损伤并未减轻，如肺缺血再灌注，可导致肺毛细胞血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞受损，从而引起呼吸障碍[1-2]。缺血再灌注多发生于外科手术中，常见的处理方式为缺血预处理、远距调节方式等[2-3]，其中缺血预处理主要有吸入七氟醚，作为全身麻醉中常用吸入型药物，可减轻气道阻力和炎症，从而改善通气功能和减轻组织缺血再灌注损伤，可控性和操作性较强，但是诱导期和恢复期容易产生不适，从而导致躁动，影响手术过程，同时在受到手术刺激时，会导致血液黏度升高，增加血栓形成的可能，影响手术治疗以及预后效果[4-5]。亚甲蓝是吩噻嗪类化合物，易透过血脑屏障，可有效穿过线粒体膜，减轻缺血再灌注引起的线粒体损伤，氧化型和还原型的特点保证了较强的抗氧化及增强代谢的能力[6]，但是，目前关于其能在缺血再灌注中的应用并不多见，其是否能够达到与七氟醚相同的疗效，同时改善血液黏度，以及在缺血再灌注损伤中对机体血清及肺组织氧化应激指标及炎症因子影响的有待进一步考察，本文以大鼠为模型动物探讨两者差异，为实际应用提供指导。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只二级清洁雄性SD大鼠，体重180～220 g，由四川省人民医院实验室动物中心提供[SCXK(川)2018-15]，[SYXK(川)2018-110]。本研究使用大鼠的实验过程均经过我院伦理委员会的批准。将60只大鼠根据随机数字表法随机分成4组，每组15只。

1.2 主要试剂与仪器

七氟醚购自于恒瑞医药有限公司；亚甲蓝购自于济川药业集团有限公司；二甲基亚砜、PBS、甲醇、戊巴比妥钠等均购自于Sigma公司；ELISA试剂盒购自于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验方法

SD大鼠根据随机数字表法分成四组，术前12 h禁食，自由饮水。称重后于腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g)，动物麻醉后取仰卧位固定于手术台上并消毒。于尾静脉注射肝素100 U/kg，气管切开后插管并行正压通气，保持大鼠呼吸频率为每分钟70次，潮气量稳定在8.0～9.0 mL/kg范围内。于左侧胸骨第5肋间开胸，随后于左心室近心尖处注射肝素500 U/kg，便于分离左侧肺动脉。用无损伤血管钳夹阻断近心端左肺动脉，吸气末则用血管钳阻断左主支气管，造成左肺缺血。假手术组(空白对照组)只需分离大鼠左侧肺门和肺动静脉，无需进行阻断。肺缺血再灌注组(IR对照组)在肺缺血1 h后放开，随后再灌注2 h即可。MB组和S组建模方法同IR组，其中假手术组和IR组灌注前5 min于腹腔注射生理盐水即可，而MB组灌注前5 min于腹腔注射5 mg/kg 亚甲蓝，而S组需在灌注前5 min于呼吸管上添加七氟醚，并保持肺中检测到的七氟醚浓度稳定在2.1%即可。

1.3.1 检测指标

血液流变学指标的检测：分别于麻醉前 (T0)、麻醉诱导后30 min (T1)、灌注2 h (T2)，检查患者红细胞变形指数、红细胞聚集指数、血浆黏度。并于灌注2 h 后，经麻醉处死前先空腹采外周静脉血5 mL，3000 r /min离心20 min，于-20℃暂存。经麻醉后处死，取左肺组织，将其分成2等份。一份用于检测肺组织湿/干质量比，即生理盐水冲洗并去除多余水分称肺湿重，于80℃烘烤24 h后称干质量，计算湿/干质量比。另一半肺组织制成10%匀浆液，4℃ 3000 r/min离心10 min，采用BCA法测蛋白浓度检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)以及三磷酸腺苷(ATP)含量。按相应酶联免疫试剂盒说明操作测定血清和肺组织匀浆液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 四组大鼠肺组织湿/干质量比

MB组、S组的肺组织湿/干质量比显著高于假手术组，且显著低于IR组，MB组、S组的肺湿重显著低于IR组，其中MB组的肺湿重显著高于假手术组，具有统计学差异(P<0.05)。MB组、S组的肺湿重和湿/干质量比无统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2 四组大鼠肺组织氧化应激指标

MB组、S组的SOD、ATP水平显著低于对照组，显著高于IR组，同时MDA和ROS显著高于对照组，显著低于IR组，具有统计学差异(P<0.05)，而MB组、S组各氧化应激指标组间比较无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表1 四组大鼠肺组织湿/干质量比

注：与假手术组相比，aP<0.05；与IR组相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表2 四组大鼠的肺组织氧化应激指标

注：与假手术组相比，aP<0.05；与IR组相比，bP<0.05。

Note. Compared with Sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

2.3 四组大鼠肺组织炎性指标

MB组、S组肺组织各炎性指标水平显著高于对照组，显著低于IR组，具有统计学差异(P<0.05)，而MB组各炎性指标略高于S组，但组间比较无统计学差异(P>0.05)，见表3。

2.4 四组大鼠血清炎性指标

MB组、S组血清各炎性指标水平显著高于对照组，显著低于IR组，具有统计学差异(P<0.05)，而MB组、S组各炎性指标组间比较无统计学差异(P>0.05)，见表4。

2.5 两组各时间段血液流变学变化

MB组、S组T1、T2期的红细胞变形指数、红细胞聚集指数和血浆黏度均低于T0期，而IR组T1、T2期各指数均高于T0期，MB组T1、T2期各指数均低于S组，差异有统计学意义 (P<0.05)，见表5。

3 讨论

肺缺血再灌注损伤是机体组织器官因血流供应不足或受阻而迅速引起的肺组织损伤，如肺毛细胞血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞受损等，与ROS大量产生而引起的氧化应激，组织炎症细胞聚集，或者炎性因子的大量产生密切关联[6]。缺血再灌注损伤常见的处理方式为缺血预处理、远距调节方式等，常用的模型为结扎法制作的肺缺血再灌注损伤。其中，缺血预处理主要有吸入七氟醚，但关于腹腔注射亚甲蓝的应用效果并未得到广泛认可，因此本文以SD大鼠肺缺血再灌注损伤为模型探讨七氟醚、亚甲蓝在调控氧化应激、炎症反应、血液流变学方面的区别，旨在为亚甲蓝的应用提供依据。研究显示，MB组、S组的肺组织湿/干质量比显著高于假手术组，且显著低于IR组，表明大鼠肺IR后存在明显的水肿，而经过七氟醚或者亚甲蓝预处理后，均可有效减轻水肿，但不能完全避免水肿的发生，而MB组、S组的肺湿重和湿/干质量比无统计学差异，表明两组对于水肿的改善效果相近。研究发现MB组、S组的SOD、ATP水平显著低于对照组，显著高于IR组，同时MDA和ROS显著高于对照组，显著低于IR组，与孙雷等报道相符[1,7]。进一步表明大鼠肺IR损伤后存在明显氧化应激反应，而经过七氟醚或者亚甲蓝预处理后，均可一定程度减轻氧化应激反应，而MB组、S组各氧化应激指标组间比较无统计学差异，说明腹腔注射亚甲蓝在改善氧化应激方面能够达到与七氟醚相同的疗效。分析认为，大鼠肺IR后肺细胞上线粒体电子传递链的电子渗漏到氧上以及细胞中酶的催化反应导致ROS增多，ROS不可逆地破坏细胞内蛋白质、脂质等结构，引发脂质过氧化，从而产生MDA，破坏细胞膜，还导致细胞酶系统遭受破坏，使得SOD水平降低，同时SOD 的降低又导致不能正常清除ROS活性，使得细胞内氧化还原失去平衡，阻断能量代谢导致ATP水平降低，引起氧化应激反应，导致细胞结构被破坏和细胞死亡[7-8]。MB组大鼠接受亚甲蓝预处理后，可通过增强Cyt C氧化酶的活性而促进ATP的生成，通过激活Nrf2/ARE通路而增强组织抗氧化作用，从而降低ROS水平，故而也降低MDA水平和增加SOD水平，减轻了氧化应激对肺组织的损伤[9-10]。而S组接受七氟醚预处理，通过优化大鼠有氧代谢率和扩张支气管及肺血管，从而增加肺组织供氧和改善肺顺应性，同时在体内代谢过程中可产生过氧化物，提前激活抗氧化机制以及清除氧自由基，改善氧化应激水平[11]。尽管，两者作用机制不同，但均可改善大鼠肺缺血再灌注损伤状态，从而保护对肺损伤，为亚甲蓝在肺缺血再灌注损伤中的应用提供依据。

表3 四组大鼠肺组织炎性指标

注：与假手术组相比，aP<0.05；与IR组相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表4 四组大鼠血清炎性指标

注：与假手术组相比，aP<0.05；与IR组相比，bP<0.05。

Note. Compared with sham group,aP<0.05. Compared with IR group,bP<0.05.

表5 两组各时间段血液流变学的变化

注：与T0期相比，aP<0.05；与IR组同时间点相比，bP<0.05；与MB组相同时间点相比，cP<0.05。

Note. Compared with the T0 phase,aP<0.05. Compared with the same time point of the IR group,bP<0.05. Compared with the same time point of the MB group,cP<0.05.

当机体发生缺血再灌注损伤时，机体病灶部位可产生大量ROS，同时趋化和激活大量中性粒细胞、巨噬细胞，从而刺激免疫细胞产生大量炎症因子并释放入血，如 IL-1β、IL-6、TNF-α[5,12]。炎症细胞因子是引起肺泡损伤的重要原因，单核细胞生成的TNF-α可增强中性粒细胞的吞噬作用，促进IL-1β、IL-6的分泌，进而启动炎症级联放大反应，促进血管内皮细胞与中性粒细胞的粘附，从而增加肺血管通透性，使得肺组织炎症因子水平进一步增加，加剧局部炎症反应，引起肺细胞损伤。本次研究结果显示，MB组、S组肺组织和血清各炎性指标水平显著高于对照组，显著低于IR组，表明大鼠肺IR损伤后存在明显的炎症反应，而经过七氟醚或者亚甲蓝预处理后，均可一定程度减轻炎症反应，而MB组、S组各炎症因子水平组间比较无统计学差异，说明腹腔注射亚甲蓝在改善炎症方面能够达到与七氟醚相同的疗效。七氟醚在清除ROS的同时，可抑制内皮和中性粒细胞间的粘附，减轻肺组织损伤，减少损伤刺激，同时下调肺组织细胞中基质金属蛋白酶的表达，从而维持细胞膜和基质稳定性，使得细胞正常运转，从而降低了炎症刺激[7,13]，故而表现为IL-1β、IL-6、TNF-α水平的降低。MB组大鼠接受亚甲蓝预处理后，由于其良好的膜通透性使之容易进入线粒体中，其的高度自动氧化特性使之可以在氧化态和还原态之间自由切换，从而维持线粒体电子传递链的运转，稳定线粒体功能[14-15]，降低ROS水平，避免细胞氧化应激引起的细胞损伤和凋亡，从而降低炎症刺激和炎症因子水平。氧化应激反应和炎症反应关系密切，氧化应激反应引起的细胞损伤和凋亡可诱导炎症反应，本次研究中发现使用七氟醚或亚甲蓝预处理后，均可改善大鼠氧化应激状态和降低炎症因子水平，可相互佐证，同时通过肺组织水肿状态可以直观反应。但进一步研究血液流变学指标发现，IR组T1、T2期红细胞变形指数、红细胞聚集指数和血浆黏度均高于T0期，MB组T1、T2期各指数均低于S组，表明亚甲蓝、七氟醚均可改善血液黏度，但亚甲蓝效果更优，推测是亚甲蓝能够通过改善炎症反应和氧化应激反应，以及减少血管阻力，从而使血液黏度降低，稳定血流动力学状态，降低血栓形成风险。

综上所述，亚甲蓝与七氟醚均可改善肺缺血再灌注损伤大鼠中肺组织氧化应激指标，降低血清及肺组织炎症因子水平，改善水肿状态，但亚甲蓝改善血液黏度效果更显著，可有效降低血栓形成风险。