人正常肝细胞LO2感染HBV后表达CCL22

李 莉，李 刚，曹 红，舒 欣，胡立立，关 瀛，罗雪艳

(1. 贵州省黔西南州人民医院全科医学科，贵州 兴义 562400； 2.中山大学附属第三医院感染性疾病科， 广州 510630；3.贵州省黔西南州人民医院肿瘤科，贵州 兴义 562400；4.贵州省黔西南州人民医院，贵州 兴义 562400)

全球有约3.5亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)，感染HBV后易发展为肝硬化、肝癌等疾病[1]。通常，HBV在肝细胞内的复制不会对肝细胞造成损伤，但机体免疫系统对病毒抗原的免疫反应会在清除病毒的同时损伤肝组织[2]。研究显示，慢性乙型病毒性肝炎(chronic viral hepatitis B, CHB)患者的肝组织会浸润大量Th17细胞，并且Th17细胞与CHB炎症程度呈正相关[3]。CHB患者血清中趋化因子CC亚家族水平均比正常人增高，且随着CHB患者病情的加重，血清中RANTES、MIF浓度逐渐升高，血清RANTES水平与ALT、AST和TBIL呈正相关，RANTES水平可反映肝脏炎症活动及损害情况，参与CHB发病[3]。但CHB肝组织浸润Th17细胞的分子机制中尚不清楚。Yang等[4]发现由HBV诱导升高的TGF-β可抑制microRNA-34a的表达，导致趋化因子CCL22的产生增加。Kim等[5]发现IL-32基因在HT-29细胞中的诱导IL-8，TNF-α和CCL2表达。但HBV感染后，CCL22的产生是否依赖IL-32仍然未知。Xiang等[6]发现HBV的HBc蛋白能够调控CREB的磷酸化并激活CREB通路。Poole等[7]发现人巨细胞病毒感染人成纤维细胞HFF细胞后CREB通路的激活会产生CCL22。基于此，本文旨在探讨HBV感染人正常肝细胞LO2细胞后表达趋化因子CCL22的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人急性单核细胞白血病细胞THP-1购自北纳生物公司(货号：BNCC100496)；人正常肝细胞LO2购自湘雅细胞库(HTCC编号：1)。HBV病毒获赠于华中科技大学同济医学院及中国科学院武汉病毒所。

1.2 主要试剂与仪器

外源人类重组IL-32和TNF-α蛋白购自ABCAM公司(货号：ab117198，ab9642)；小分子抑制剂Forskolin购自Selleck公司(货号：S2449)； RPMI-1640培养基购自GE health公司(货号：SH30091)；DMEDM培养基购自北京索莱宝公司(货号：11965)；胎牛血清购自Thermo Fisher Scientific公司(货号：10099-133)；CCL22、TNF-α和IL-32的ELISA试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司(货号：BYE10457，BYE10038，BYE10123)；逆转录试剂盒购自TaKaRa公司(货号：RR037A)； RT-qPCR试剂盒购自南京诺唯赞公司(货号：Q711)。CREB抗体，p-CREB抗体和tubulin抗体购自CST公司(货号：9197, 9198, 2146)。

Western blot装置(Bio-Rad, 货号：#1658004)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific, 货号：51119700)；细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific, 货号：51026331)；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific, 货号：51022485)。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR

采用Trizol法抽取总RNA。利用核酸蛋白检测仪测定样品的OD230、OD260和OD280，OD260与OD280的比值在1.7至2.0之间，用1%的琼脂糖胶进行电泳检测提取的RNA质量，5S、18S和28S的条带清晰可见。用Takara逆转录试剂盒将提取的总RNA中的mRNA逆转录为cDNA。用南京诺唯赞RT-qPCR试剂盒，在ABI的qPCR仪进行RT-qPCR反应。使用Primer 5.0设计qPCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1。将LO2细胞分为两组，一组感染HBV，另一组不感染。使用实时荧光定量PCR测定IL-32的mRNA相对表达量(图1上)；PCR结束后，进行2%的琼脂糖电泳(图1下)。将THP-1细胞分为两组，一组用外源人类重组IL-32蛋白刺激，一组不刺激。使用实时荧光定量PCR测定TNF-α的mRNA相对表达量(图3上)；PCR结束后，进行2%的琼脂糖电泳(图3下)。

1.3.2 细胞培养、药物处理和病毒感染

THP-1维持在补充有2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中的潮湿气氛(37℃，5% CO2)中，添加100 U/mL青霉素,100 μg/ mL链霉素和10%热灭活的FBS。LO2细胞维持在补充有DMEM培养基中的潮湿气氛(37℃，5%CO2)中，添加100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素和10%热灭活的FBS。IL-32终浓度为0.4 μg/mL；TNF-α终浓度分别为0、5、10、15 ng/mL。处理24 h后收细胞。LO2和THP-1细胞感染30MOI的HBV，感染后24 h的细胞用于后续试验。

1.3.3 免疫印迹

进行10%或12% SDS-PAGE的电泳，然后转移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔径)。将PVDF膜在室温下在含有0.01% Tween-20和5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(10 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5, 150 mmol/L NaCl)中封闭1 h，然后在4℃下与目的蛋白的抗体温育过夜。然后将膜在室温下与缀合有HRP的相应二抗孵育1 h。观察特定蛋白质使用ECL Plus Western印迹检测系统

1.3.4 酶联吸附试验

将包被缓冲液中的抗原(5～20 μg/ mL)加入到微量滴定板中。在37°C孵育4 h，然后在4°C下储存直至使用。用洗涤液洗涤三次，在洗涤之间等待10 min。通过完全填充管或所有孔，用0.5%BSA封闭1 h。用洗涤液清洗4次，等待10 min。向每个孔中加入100 μL用PBS-TA稀释的抗血清，在室温下孵育5 h或在冰箱中孵育过夜。如前所述洗涤平板，然后加入用PBS-T稀释的缀合物。在室温下1.5 h或在37℃下1 h。洗涤4次，然后向每个孔中加入100 μL底物。加入100 μL 1 mol/L磷酸停止反应。读取450 nm数据。将LO2细胞分为两组，一组感染HBV，另一组不感染。使用ELISA试验对LO2细胞培养基上清中的IL-32进行蛋白表达量的测定。将THP-1细胞分为两组，一组用外源人类重组IL-32蛋白刺激，一组不刺激。使用ELISA试验对THP-1细胞培养基上清中的TNF-α进行蛋白表达量的测定。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 HBV诱导LO2细胞表达IL-32

通过qPCR和ELISA发现感染了HBV的LO2细胞能够表达和分泌IL-32。相对于不感染组，感染了HBV的LO2细胞能够表达表达IL-32的mRNA，相应的能够检测到LO2细胞上清中的IL-32分泌蛋白。基于此，HBV诱导LO2细胞表达IL-32。(图1、图2)

注： ***P<0.001。图1 感染与未感染HBV的LO2细胞中IL-32 mRNA的相对表达量Note. ***P<0.001.Figure 1 The relative expression of IL-32 mRNA in the HBV-infected and uninfected LO2 cells.

注： ***P<0.001。图2 HBV感染与未感染的LO2细胞中IL-32 蛋白表达量的比较Note.***P<0.001.Figure 2 Comparison of the IL-32 protein levels in the HBV-infected and -uninfected LO2 cells

2.2 病毒诱导的IL-32诱导THP-1细胞分泌TNF-α

发现用人IL-32刺激后的THP-1细胞能够表达和分泌TNF-α。将THP-1细胞和LO2细胞共培养，TNF-α并没有表达。用HBV感染THP-1细胞，TNF-α略微表达(图3、图4)。只有在THP-1细胞和LO2细胞共培养时，再用HBV感染细胞，TNF-α才能表达(图5)。基于此，病毒诱导的IL-32诱导THP-1细胞分泌TNF-α。

注： ***P<0.001。图3 IL-32感染与未感染的LO2细胞中TNF-αmRNA相对表达量的比较Note. ***P<0.001.Figure 3 Relative mRNA expression of TNF-α in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells

注：IL-32刺激与不刺激时TNF-α 蛋白量的对比，***P<0.001。图4 TNF-α的蛋白表达量Note. Comparison of TNF-α protein expression in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells，***P<0.001.Figure 4 Comparison of TNF-α protein expression in the IL-32-stimulated and unstimulated LO2 cells

注：TNF-α 蛋白量与control的对比， *P<0.05。图5 病毒诱导的IL-32诱导THP-1细胞分泌TNF-αNote. The ratio of TNF-α protein in the treated cells to that of the control cells，*P<0.05.Figure 5 Virus-induced IL-32 in turn induces the secretion of TNF-α by THP-1 cells

图6 外源刺激随梯度增加的TNF-α时CREB和p-CREB的表达量Figure 6 Expression of CREB and p-CREB upon stimulation with increasing exogenous TNF-α

2.3 TNF-α诱导LO2细胞活化CREB通路

在LO2细胞中，外源刺激随梯度增加的TNF-α，CREB的表达量并没有明显变化，而磷酸化的CREB的含量随TNF-α浓度的升高而升高(图6)。用imageJ软件量化条带后，可以明显看到P-CREB的含量随TNF-α浓度的升高而升高(图7)。THP-1细胞和LO2细胞共培养时，p-CREB的表达量与对照基本无区别。HBV感染THP-1细胞时，p-CREB的表达量也几乎无区别。只有在THP-1细胞和LO2细胞共培养且HBV感染细胞时，p-CREB的表达量显著增加(图8)。基于此，TNF-α能诱导LO2细胞活化CREB通路，且THP-1细胞和LO2细胞共培养后用HBV感染能使p-CREB的表达量上升。基于此，TNF-α诱导LO2细胞活化CREB通路。

注：TNF-α梯度增加时p-CREB表达量与最低浓度TNF-α时p-CREB表达量对比，*P<0.05。图7 LO2细胞中外源刺激随梯度增加的TNF-α时CREB和p-CREB的表达量Note. Comparison of p-CREB expression at the lowest concentration of TNF-α with that under conditions of increased TNF-α concentration， *P<0.05.Figure 7 Expression of CREB and p-CREB in the LO2 cells upon stimulation with increasing exogenous TNF-α

图8 不同条件下p-CREB的表达情况Figure 8 Expression of p-CREB under different conditions

2.4 CREB通路活化后促使LO2表达趋化因子CCL22

注：TNF-α刺激与否时CCL22 mRNA表达量比较，***P<0.001。图9 TNF-α刺激与否时CCL22 mRNA表达量水平的比较Note. Comparison of CCL22 mRNA expression when TNF-α stimulation was applied or not，***P<0.001.Figure 9 Comparison of CCL22 mRNA expression when TNF-α stimulation was applied or not

注：TNF-α刺激与否时CCL22 蛋白表达量比较：***P<0.001。图10 TNF-α刺激与否时CCL22 蛋白表达量水平的比较Note: Comparison of CCL22 protein expression levels when TNF-α stimulation was applied or not，***P<0.001.Figure 10 Comparison of CCL22 protein expression levels when TNF-α stimulation was applied or not

外源TNF-α刺激LO2细胞时，在mRNA水平上CCL22的表达量显著增高(图9)，且在蛋白水平上CCL22的表达量显著增高(图10)。THP-1和LO2细胞共培养且TNF-α刺激时，在蛋白水平上CCL22的表达量显著增高(图11)。THP-1和LO2细胞共培养且HBV感染时，在蛋白水平上CCL22的表达量显著增高(图11)。但是，这两种CCL22表达量升高均能被小分子抑制剂Forskolin抑制(图11)。为了排除趋化因子CCL22是THP-1细胞产生的，用TNF-α刺激或感染HBV细胞时，发现CCL22蛋白水平的变化并没有统计学意义(图12)。基于此，CREB通路活化后促使LO2表达趋化因子CCL22。

注：不同条件下CCL22的表达量与control对比,***P<0.001。图11 不同条件下CCL22的蛋白表达量Note. CCL22 protein expressions under different conditions compared with that of the controls，***P<0.001.Figure 11 CCL22 protein expressions under different conditions compared with that of the controls

注：CCL22的表达量与control对比，P>0.05。图12 THP-1细胞不同条件下CCL22表达量的对比Note. Compared with the control cells, P>0.05. Figure 12 Comparison of CCL22 expression in the THP-1 cells under different conditions

3 讨论

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影响全世界大约3.75亿人[8]。目前其可以被抗病毒治疗有效控制，但很少能够完全清除慢性HBV感染[9]。此外，很大一部分慢性HBV感染患者不适合目前可用的抗病毒治疗，并且仍然面临肝硬化和肝细胞癌的高风险[8]。然而，对HBV感染的发病机制知之甚少是制定更有效治疗策略的主要障碍[10]。HBV发病机制的核心假设在于认为乙型肝炎是宿主特异性免疫介导的肝脏疾病[11]。大量的研究证实CD8+T细胞及非抗原特异性的淋巴细胞浸润慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的肝组织[2]。

Zhang等[12]研究发现mDCs、pDCs在CHB患者的肝组织内大量聚集，参与HBV感染后的肝损伤；且MIG、IP-10、IL-6等细胞因子在CHB肝组织中表达增高，并发现HBV的HBx蛋白通过活化NF-κβ诱导肝细胞表达MIG[13]、IP-10[14]、IL-6[15]，MIG、IP-10可以诱导免疫细胞聚集肝脏，IL-6可以诱导免疫反应、炎症反应、调节肝内急性期反应蛋白的合成。而本研究发现，HBV感染的LO2人肝细胞能够被诱导表达IL-32。IL-32调节细胞生长、代谢和免疫调节，是参与炎症性疾病的病理调节剂或保护剂[16]。IL-32具有3种剪接变体IL-32α、IL-32β和 IL-32γ，其中IL-32γ在其N-末端具有疏水信号肽，这是分泌细胞因子的典型特征。基于此，推测HBV感染的LO2细胞后诱导产生并分泌的IL-32是IL-32γ。并且IL-32能够诱导THP-1细胞分泌TNF-α。TNF-α作为最重要的促炎细胞因子之一，通过诱导粘附分子的表达参与血管舒张和水肿的形成，以及白细胞与上皮细胞的粘附[17]。有研究发现，TNF-α水平降低后，CREB和pCREB的表达水平均明显升高[18]。本研究发现，通过外源TNF-α刺激LO2细胞，其胞内CREB磷酸化水平明显增高，CREB通路被激活。且活化后的CREB通路促使LO2表达了趋化因子CCL22。此外THP-1细胞和LO2细胞共培养后，再用HBV病毒感染，CREB通路同样被活化，趋化因子CCL22同样表达。但这两种途径致使的CCL22表达能被小分子抑制剂Forskolin阻断。Forskolin是一种腺苷酸环化酶的激活剂，其增加细胞内cAMP水平。cAMP能够诱导CREB在Ser133发生磷酸化，来募集CBP以激活转录[19]。而趋化因子CCL22在正常的肝组织中并不表达，但是Riezu-Boj等[20]研究发现慢性丙肝患者肝内CCL17、CCL22表达增高，HCV可以诱导CCL17、CCL22表达，增高的CCL17、CCL22诱导Treg聚集于肝组织。基于此，研究人员推测HBV感染宿主肝细胞后，诱导肝细胞表达IL-32，之后作为分泌蛋白的IL-32刺激巨噬细胞表达分泌蛋白TNF-α，然后TNF-α又刺激肝细胞表达趋化因子CCL22。之后，CCL22/CCR4介导Treg细胞浸润至慢性肝炎患者的肝组织。而肝内Treg细胞高表达CXCR3、CCR4等趋化因子[21]，介导Th17细胞等免疫细胞浸润至慢性肝炎患者的肝组织。最后，肝内聚集的免疫细胞及细胞因子导致CHB患者肝损伤。

综上所述，IL-32诱导THP-1细胞分泌的TNF-α促进HBV感染的LO2细胞表达趋化因子CCL22。