RGD多肽修饰的芬维A铵脂质体对恶性黑素瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响

王梦蛟 崔艾丽 金承龙 方宇辉 金哲虎

延边大学附属医院皮肤科，吉林 延吉 133000

恶性黑素瘤是一种发病率较低但恶性度高、侵袭性强、死亡率高的皮肤癌［1］，始源于黑素细胞的异常增殖［2］。芬维A铵［fenretinide，N-（4-hydroxyphenyl）retinamide，4-HPR］是新一代合成的全反式维A酸类衍生物，与传统维A酸相比，4-HPR毒性小、不良反应少且耐受率高，在多种肿瘤中发挥调节分化、抗侵袭、抑制生长和诱导凋亡等作用［3］，据报道也可显著抑制黑素瘤细胞的增殖［4］。但其疏水性极强，导致生物利用度。但其疏水性极强，导致生物利用度低，难以达到满意的治疗效果。脂质体是一种无毒性及免疫原性的药物载体，含有类细胞膜的脂质双分子层结构，具有降低药物毒性、减少不良反应、提高药物治疗指数等优点，并且可以使药物在肿瘤内蓄积达到被动靶向作用。药物的靶向递送是近年来的研究热点，靶向蛋白的应用被大量研究并具有良好的效果。整合素是表达于细胞表面的具有信号传递作用的跨膜受体，其中整合素αvβ3在包括人恶性黑素瘤细胞的多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤的发生中具有重要作用［5-7］，精氨酸（R）-甘氨酸（G）-天冬氨酸（D）（RGD）序列是广泛认可的靶向整合素αvβ3的多肽序列［8］。本研究中我们将4-HPR以脂质体进行包载以提高水溶性，并且采用RGD多肽对脂质体进行修饰，通过其与黑素瘤细胞表面整合素αvβ3的特异性结合以实现药物向肿瘤细胞的靶向递送，并检测4-HPR对B16F10和A375细胞的增殖、迁移抑制及凋亡诱导作用，和cRGDfk修饰4-HPR脂质体对该作用的影响。

材料与方法

一、材料

鼠源高转移性恶性黑素瘤B16F10细胞和人黑素瘤A375细胞（来自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心），以含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃5%CO2培养箱内培养。

4-HPR、胆固醇、甲醇［高效液相色谱（HPLC）级］、细胞计数试剂盒8（CCK8）均为美国Sigma-Aldrich公司产品，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000）为美国Laysan Bio公司产品，蛋黄卵磷脂为上海东尚生物科技有限公司产品，巯基丙酸-cRGDfk为上海强耀生物科技有限公司产品，胎牛血清、DMEM高糖培养基为美国Hyclone公司产品，细胞凋亡检测试剂盒为北京四正柏生物科技有限公司产品，Agilent 1260型HPLC仪来自美国Agilent公司，JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎机来自宁波新芝生物科技股份有限公司，Malvern Nano ZS型激光粒度分析仪来自英国Malvern公司，Spectra Max190型酶标仪来自美国MD公司，EPICS XL型流式细胞分析仪为美国Beckman Coulter公司产品。

二、实验方法

1.薄膜-水化法制备芬维A铵脂质体（4-HPRL）及RGD多肽修饰的4-HPRL（RGD-4-HPRL）：将巯基丙酸-cRGDfk与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-mPEG-mal）按摩尔比1∶1溶于去离子水，氮气保护下常温反应24 h，反应结束后以双蒸水透析48 h，冷冻干燥后得到RGD-DSPE-mPEG，以三氯甲烷为溶剂，以核磁共振氢谱（1H NMR）600 MHz鉴定其结构。称取4-HPR 9 mg，胆固醇7.5 mg，含或不含RGDDSPE-mPEG的DSPE-mPEG 9 mg（RGD-4-HPRL中RGD-DSPE-mPEG占1/10），蛋黄卵磷脂84 mg，置于250 ml圆底烧瓶内，加入3 ml三氯甲烷溶解，50℃旋蒸干燥30 min至形成均匀薄膜，加入5%葡萄糖溶液6 ml水化，探头超声（超声参数：超声2 s，停1 s，能量150 W，时间15 min）后用直径0.22 μm水膜过滤3次除去游离药物，即得4-HPRL或RGD-4-HPRL的溶液。使用马尔文粒径仪检测粒径和电位，HPLC检测4-HPR浓度，并测定包封率和载药量。

2.细胞活性检测：

（1）脂质体材料对细胞活性的影响：取对数生长期的B16F10和A375细胞，0.25%胰酶常规消化后500×g离心4 min，按5×103个/孔接种于96孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，分为对照组、调零组和5个实验组，每组6孔，调零组不给予任何处理，对照组加入新鲜DMEM培养液，实验组分别加入含不同浓度（同1、10、20、30、50、100 mg/L 4-HPR组）空白脂质体的DMEM培养液，继续培养24h，后以CCK8试剂进行染色［4］。酶标仪测定450nm波长处吸光度（A）值并计算细胞活性：细胞活性（%）=［（A实验组-A调零组）/（A对照组-A调零组）］×100%。

（2）4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL对B16F10和A375细胞活性的影响：细胞培养及分组方法同上，实验组分别加入含有不同浓度（4-HPR浓度均分别为10、20、30和50 mg/L）4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培养液，每孔200 μl。24 h后染色并采用酶标仪检测各组A450值，按上述方法计算细胞活性。

3.膜联蛋白V/碘化丙锭染色检测细胞凋亡：按1.5×105个/孔分别接种两种细胞于6孔板内，每孔加入1 ml培养液，培养24 h后，分成对照组、4-HPR组、4-HPR-L组和RGD-4-HPRL组，每组3孔，对照组加入2 ml新鲜培养液，给药组分别加入含4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培养液2 ml，其中4-HPR浓度均为10（B16F10细胞）或20 mg/L（A375细胞），继续培养24 h后收集细胞并染色，检测每孔细胞凋亡比例并统计分析［4］。早期凋亡细胞可以结合膜联蛋白V，细胞显示在右下象限；晚期凋亡细胞膜通透性增加，碘化丙锭可以进入细胞核与DNA结合，细胞显示在右上象限。总凋亡细胞即早期凋亡与晚期凋亡细胞之和。

4.细胞划痕实验：分别取B16F10细胞和A375细胞，以1.0×105个/孔的密度接种于12孔板，每孔加入1 ml培养液，培养24 h后分成对照组、4-HPR组、4-HPR-L组和RGD-4-HPRL组，每组3孔，对照组加入2 ml新鲜培养液，实验组分别给予4-HPR浓度为10 mg/L（B16F10细胞）或20 mg/L（A375细胞）的4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培养液1 ml，分别于给药后即刻、24 h和48 h倒置显微镜下观察划痕愈合情况并拍照。

5.B16F10细胞对香豆素6（C6）的摄取情况：以C6取代4-HPR制备C6L和RGD-C6L。取B16F10细胞以1.5×105/孔接种于6孔板，24 h后分为对照组、C6组、C6L组及RGD-C6L组，每组3个复孔，分别加入含有1 mg/L C6的上述制剂的无血清DMEM培养液，继续培养5 min，冷PBS漂洗3次，胰酶消化，500×g离心收集细胞，流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。

6.统计学分析：采用SPSS Statistics 22.0软件分析，计量数据以±s表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、RGD-DSPE-mPEG表征

1H NMR对DSPE-mPEG和RGD-DSPE-mPEG结构的鉴定结果显示，DSPE-mPEG在化学位移6.70×10-6处有马来酰亚胺中的α，β-不饱和双键氢的特征峰，RGD-DSPE-mPEG在6.70×10-6处α，β-不饱和双键氢的特征峰消失，与文献报道一致［9］。见图1。

二、4-HPRL与RGD-4-HPRL表征

通过薄膜-水化法制备的4-HPRL溶液中4-HPR浓度可高于1 300 mg/L。4-HPRL粒径为（85.31±1.36）nm，电位为（-23.13±0.57）mV；RGD-4-HPRL粒径为（90.76±0.55）nm，电位为（-24.43±0.50）mV。脂质体粒径分布均一，与4-HPRL相比，RGD-4-HPRL粒径稍有增大，电位稍有降低。4-HPRL包封率（95.51±1.22）%，载药量（7.27±0.11）%；RGD-4-HPRL包封率（95.82±0.81）%，载药量（7.14±0.13）%。4-HPRL与RGD-4-HPRL均具有较高的包封率和载药量，二者之间无明显差异。

三、细胞活性检测结果

当空白脂质体浓度分别为10、20、30、50、100 mg/L时，24 h后B16F10细胞活性分别为（101.8±1.8）%、（99.5±2.6）%、（97.6±1.4）%、（90.8±2.0）%、（83.7±0.9）%，A375细胞活性分别为（101.1±1.3）%、（96.7±1.4）%、（94.5±1.9）%、（88.7±0.9）%、（79.5±0.5）%。可见RGD-4-HPRL载药材料即RGD-空白脂质体浓度≤30 mg/L时在24 h内对B16F10细胞活性抑制低于5%，对A375细胞活性抑制低于7%，表明脂质体材料生物相容性良好，无明显细胞毒性。

由表1可见，4-HPR作用24 h可明显抑制B16F10和A375细胞活性，抑制率接近50%的4-HPR浓度分别10 mg/L和20 mg/L，所以后续实验分别采用以上浓度。4-HPR浓度相同时，RGD-4-HPRL组两种细胞的增殖抑制率明显高于4-HPR组（均P＜0.01）和4-HPRL组（P＜0.01或0.05），且4-HPRL组高于4-HPR组（均P＜0.01）。表1显示细胞增殖抑制率一般随药物浓度增加而逐渐升高，但当抑制率增加到70%以上时基本保持稳定。

四、4-HPR诱导细胞凋亡研究

见图2、表2。4-HPR可明显诱导B16F10和A375细胞发生凋亡，且以晚期凋亡为主。4组间B16F10细胞（F=2 826.830，P＜0.01）和A375细胞凋亡率（F=279.002，P＜0.01）差异均有统计学意义，其中，4-HPRL组两种细胞凋亡率均高于4-HPR组（t值分别为25.338、6.870，均P＜0.01），RGD-4-HPRL组凋亡率又高于4-HPR组（t值分别为43.152、14.016，均P＜0.01）及4-HPRL组（t值分别为8.145、10.243，均P＜0.01）。

图1 DSPE-mPEG-mal与RGD-DSPE-mPEG的1H NMR鉴定图谱1A为DSPE-mPEG-mal核磁图谱，可见6.70×10-6处马来酰亚胺特征峰；1B为RGD-DSPE-mPEG核磁图谱，6.70×10-6处马来酰亚胺特征峰消失。DSPE-mPEG：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；DSPE-mPEG-mal：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺

表1 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL对B16F10细胞和A375细胞增殖的抑制率比较（±s）

表1 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL对B16F10细胞和A375细胞增殖的抑制率比较（±s）

注：n=4。相同浓度条件下，a与4-HPR组同种细胞相比，P＜0.01；与4-HPRL组同种细胞相比，bP＜0.01，cP＜0.05。4-HPR：芬维A铵；4-HPRL：4-HPR脂质体；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的环形多肽cRGDfk修饰的4-HPRL

4-HPR浓度（mg/L）10 20 30 50 F值P值B16F10（%）A375（%）4-HPR组38.5±2.7 47.3±3.9 50.6±3.2 62.4±0.9 35.254＜0.01 4-HPRL组55.7±0.5a 68.1±1.8a 73.0±1.4a 74.8±0.7a 155.653＜0.01 RGD-4-HPRL组69.3±1.9a b 73.7±1.2a b 75.1±2.2a 73.5±1.4a 6.495＜0.05 4-HPR组19.6±0.2 27.0±2.4 39.7±0.7 49.9±1.7 180.082＜0.01 4-HPRL组36.8±0.8a 44.9±1.5a 51.0±2.3a 58.7±2.0a 84.322＜0.01 RGD-4-HPRL组38.9±0.8a c 54.9±1.5a b 61.7±0.1a b 65.9±0.4a b 552.903＜0.01

图2 4-HPR作用24 h对B16F10细胞和A375细胞凋亡的影响4-HPR：芬维A铵；4-HPRL：4-HPR脂质体；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的环形多肽cRGDfk修饰的4-HPRL

表2 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL对B16F10细胞和A375细胞凋亡率的影响（±s，%）

表2 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL对B16F10细胞和A375细胞凋亡率的影响（±s，%）

注：n=3。a与对照组相比，P＜0.01；b与4-HPR组相比，P＜0.01；c与4-HPRL组相比，P＜0.01。4-HPR：芬维A铵；4-HPRL：4-HPR脂质体；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的环形多肽cRGDfk修饰的4-HPRL

分组对照组4-HPR组4-HPRL组RGD-4-HPRL组B16F10细胞4.44±0.35 28.33±0.66a 46.43±0.77a b 51.33±0.37a b c A375细胞4.97±0.62 16.68±3.81a 32.62±1.24a b 44.85±4.92a b c

五、4-HPR抑制细胞迁移

见图3。给药后24 h，对照组已有愈合倾向，而实验组愈合不明显；48 h后对照组划痕基本愈合，4-HPR组划痕变窄但仍清晰可见，而4-HPRL组和RGD-4-HPRL组划痕愈合明显减慢。

六、B16F10细胞对C6的摄取情况

孵育5 min后，细胞内C6的荧光强度在对照组为2.15±0.28，C6组为8.56±0.36，C6L组为20.48±0.13，RGD-C6L组为22.55±0.07，各组间平均荧光强度差异有统计学意义（F=67 194.186，P＜0.01）。与C6组相比，C6L组与RGD-C6L组摄取量明显增加（t值分别为44.097和54.065，P＜0.01），且RGD-C6L组又多于C6L组（t值为19.611，P＜0.01）。

讨论

4-HPR作为新一代全反式维A酸衍生物，可抑制多种肿瘤细胞的增殖［4，10］，具有毒性小、不良反应发生率低等优点。本研究中，我们通过CCK8实验、划痕实验及细胞凋亡实验证实4-HPR可抑制B16F10和A375细胞增殖、迁移并诱导凋亡。但是，4-HPR水溶性极低，在使用时通常以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作为溶剂，但聚氧乙烯蓖麻油可引起人体组胺释放从而导致严重的过敏反应。脂质体作为新型药物载体，无毒性及免疫原性、适合体内降解，具有降低药物毒性、减少不良反应、提高药物治疗指数、减少药物剂量等优点，并且能够通过EPR效应使药物在肿瘤内蓄积。在本实验中采用薄膜-水化法制备的脂质体制剂对4-HPR进行包载，明显提高了4-HPR的水溶性，且粒径大小均一，并且具有较高的包封率和载药量。

整合素αvβ3是细胞黏附受体整合蛋白家族成员，不仅参与细胞黏附，还参与细胞跨膜信号的双向传导［11］，在多种肿瘤细胞包括黑素瘤和肿瘤血管内皮细胞表面高表达［12-13］，而在正常细胞表达极低或不表达，且促进肿瘤的增殖、迁移和血管生成。因此，整合素αvβ3成为肿瘤治疗的重要靶标，RGD是整合素αvβ3的特异性配体，Kang等［14］发现RGD修饰的蛇毒提取物可通过阻断整合素αvβ3抑制黑素瘤B16F10细胞的黏附和迁移。本实验中我们以cRGDfk作为靶蛋白对4-HPRL进行修饰，通过对肿瘤细胞表面的整合素αvβ3特异性结合使药物高度识别并进入肿瘤细胞，证实通过脂质体或RGD靶向蛋白修饰的脂质体对4-HPR进行包裹可显著提高4-HPR对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。C6摄取实验发现，脂质体明显增加细胞对药物的摄取速度，而对脂质体采用cRGDfk修饰后，细胞对药物的摄取进一步增多，且大量研究表明直径在100 nm左右的脂质体可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应在肿瘤内蓄积，使其更好更快地发挥细胞杀伤作用。通过细胞对RGD-C6L的摄取和反应可以看出通过RGD序列向黑素瘤细胞主动递送药物是有效的。

图3 芬维A铵（4-HPR）对B16F10和A375细胞划痕愈合的影响4A：B6F10细胞；4B：A375细胞。4-HPRL：4-HPR脂质体；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的环形多肽cRGDfk修饰的4-HPRL

将药物靶向递送到肿瘤细胞一直是我们致力研究的重点，对B16F10和A375细胞的体外研究显示，4-HPR具有明显抑制黑素瘤细胞增殖、迁移并诱导凋亡的作用，有望成为治疗黑素瘤的新型药物，而脂质体及RGD靶向脂质体可显著提高4-HPR的作用，但RGD修饰的4-HPRL对黑素瘤的体内治疗效果及优势有待进一步研究。