犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的定位研究

刘洋 徐宇 张芙蓉 谭灿 杨国玲

大连医科大学附属第一医院皮肤科 116011

犬小孢子菌可引起人畜共患的皮肤癣菌病，是我国儿童头癣的常见病原菌。本课题组前期已通过抑制消减杂交技术（SSH）成功构建犬小孢子菌差异基因文库［1］，筛选出头皮诱导培养下呈差异表达的4条基因，其中PQ-LRP基因在头皮诱导培养下较光滑皮肤呈现高表达［2］。我们通过cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术完成PQ-LRP基因全长cDNA序列的扩增和测序［3］，利用RNA干扰技术构建犬小孢子菌PQ-LRP干扰株［4］，发现PQ-LRP基因干扰株较野生株生长受限，不易感染宿主，毒力减弱，推测PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌致病毒力因子之一［5］。为研究PQ-LRP在犬小孢子菌中的定位，我们将PQ-LRP基因片段连接至增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的上游后在犬小孢子菌中表达，并对融合EGFP在细胞中的定位进行初步研究，为后期探讨该基因在头癣发病机制中的作用提供理论基础。

材料与方法

一、材料

犬小孢子菌标准株（ACTT10394）为大连医科大学附属第一医院皮肤科真菌室保存菌种，经传统培养及转录间隔区序列PCR扩增后电泳鉴定为犬小孢子菌。TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒、TaKaRa Tks Gflex DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST琼脂糖DNA提取试剂盒均为日本TaKaRa公司产品；根癌农杆菌EHA105电转感受态细胞、Premix TaqTM、大肠杆菌JM109感受态细胞、Tks Gflex®DNA聚合酶、In-Fusion®HD Cloning试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品；潮霉素产自Sigma-Aldrich（中国）公司；Trizol试剂盒为赛默飞世尔（中国）科技有限公司产品；质粒pEGFP-N1、pSilent-1、pCAMBIA1300为武汉淼灵科技有限公司产品。

二、方法

1.犬小孢子菌总RNA提取：参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用紫外分光光度计测定A260/A280比值，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA片段大小。

2.融合基因表达载体的构建及根癌农杆菌转化：①将自犬小孢子菌中提取的总RNA反转录为cDNA；②以上述cDNA为模板，引物见表1，PCR扩增PQ-LRP基因，两端添加酶切位点SacⅠ/BamHⅠ，反应条件：94℃预变性1 min，98℃变性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸60 s，共35个循环；③将pEGFPN1质粒用SacⅠ/BamHⅠ双酶切（37℃2 h），将酶切后纯化回收的pEGFP-N1载体与PQ-LRP基因片段连接（50℃15 min）得到pEGFP-LRP载体，将连接产物转化到大肠杆菌（E.coli）JM109中，提取质粒测序验证；④以pSilent-1质粒为模板，PCR扩增真菌通用启动子（Ptrpc）和真菌通用终止子（Ttrpc）序列，引物见表1；以pEGFP-LRP载体为模板，PCR扩增LRP-EGFP基因序列，扩增引物见表1，反应条件：98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸45 s，共30个循环；⑤SacⅠ/HimdⅢ双酶切pCAMBIA 1300质粒（37℃4 h），将酶切后纯化回收的pCAMBIA 1300载体与上述④中PCR扩增产物连接（50℃15 min），得到表达载体。将上述重组的表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP转化到E.coliJM109中，挑取单菌落，提取质粒送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序验证。用电转化方法将表达载体从E.coliJM109供体菌中转入根癌农杆菌EHA 105中，对阳性克隆用M13-47、RV-M引物（表1）进行PCR鉴定。

表1 构建pCAMBIA-LRP-EGFP表达载体所用引物

3.犬小孢子菌转化及转化子筛选：取1 ml吸光度A600为0.6～0.8的转化后根癌农杆菌与1 ml 5×105个/ml的犬小孢子菌分段菌丝混合，将200 μl混合液涂布于添加乙酰丁香酮（AS 200 μmol/L）的诱导平板上，25℃避光培养24、36、48、60、72 h，将共培养的含有根癌农杆菌和犬小孢子菌分段菌丝的混合物转移到诱导平板上（含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L头孢噻肟钠），25℃培养14 d直至菌落出现［4，6］。将犬小孢子菌转化子在无潮霉素的沙氏培养基上传代5次后，接种至含有潮霉素（300 mg/L）和头孢噻肟钠（200 μmol/L）的诱导平板上，检测转化子的遗传稳定性，提取上述转化子基因组DNA，PCR扩增融合基因LRP-EGFP进行验证。

4.菌丝处理及LRP-EGFP融合蛋白定位：将带有融合质粒的犬小孢子菌转化子在沙氏培养基上培养14 d后，取菌丝用PBS（pH7.4）冲洗2次，用0.5 mol/L山梨醇溶液处理后置于载玻片上用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

结果

一、融合基因表达载体的鉴定

1.pEGFP-LRP质粒PCR鉴定：用引物LRP-EGFP-F、LRP-EGFP-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约1 800 bp的目的片段，证明目的片段连接到pEGFP-N1载体中，得到载体pEGFP-LRP（图1），经测序验证为目标序列。

2.Ttrpc、Ptrpc的PCR扩增：对Ptrpc与Ttrpc基因片段的扩增产物进行电泳，分别可见约1 300 bp与780 bp左右的片段，与Ptrpc及Ttrpc基因片段相符。见图1。

3.表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP测序验证：验证结果显示，PQ-LRP与EGFP基因片段蛋白质编码区（CDS）区无突变。

二、pCAMBIA-LRP-EGFP质粒的根癌农杆菌转化结果

将pCAMBIA-LRP-EGFP质粒电转化到根癌农杆菌EHA105中，PCR鉴定显示约4 000 pb的片段（图2），证明载体转入根癌农杆菌中。

三、犬小孢子菌转化子验证

图1 LRP-EGFP、Ttrpc、Ptrpc基因片段PCR扩增产物M：标准参照物；1：Ptrpc（1 340 bp）；2：LRP-EGFP（1 838 bp）；3：Ttrpc（786 bp）图2转染pCAMBIA-LRP-EGFP质粒的根癌农杆菌M：DNA标准参照物；1：pCAMBIA-LRP-EGFP质粒

图3 犬小孢子菌转化子DNA电泳图M：标准参照物；1：犬小孢子菌转化子基因组DNA图4犬小孢子菌转化子融合基因LRP-EGFP的PCR检测M：标准参照物；1：转化子LRP-EGFP

琼脂糖凝胶电泳显示，犬小孢子菌转化子基因组DNA条带比较透明清晰，无拖带现象（图3），紫外分光光度计检测显示，浓度和纯度均达到要求，可以满足后续PCR检测。PCR扩增LRP-EGFP后琼脂糖凝胶电泳鉴定显示约1 800 bp的目的片段，证明外源基因已整合到犬小孢子菌基因组DNA中，见图4。

四、LRP-EGFP融合蛋白的细胞定位分析

共聚焦显微镜下可观察到极强的绿色荧光信号，LRP-EGFP的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于收缩的犬小孢子菌细胞的细胞膜上，见图5。

讨论

目前，已有多种多样的技术手段运用于探索蛋白质的亚细胞定位，如亚细胞定位预测、特异性抗体免疫组化定位、融合报告基因定位等，其中融合报告基因定位法因具有简单有效、准确率高、可以活体样本实时监测的优点在分子生物学研究领域应用广泛，其原理是将目的蛋白基因与标记蛋白基因拼接融合共表达，通过检测标记蛋白研究目标蛋白，最常见的报告分子为GFP，是一种由239个氨基酸组成的单体蛋白［7］，其荧光反应不需要任何底物及辅助因子，荧光稳定，且其分子量相对较小，与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能。本研究所用EGFP是将GFP的Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使荧光强度提高35倍，而且激发后16～24 h仍可稳定地检测到荧光［8］。我们成功构建了pCAMBIA-LRP-EGFP表达载体，利用根癌农杆菌转化将融合基因整合到犬小孢子菌基因组DNA，实现了Ptrpc和Ttrpc调控下LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中的表达。将转化后犬小孢子菌菌丝用0.5 mol/L山梨醇处理使其脱水，细胞膜与细胞壁分离后发现LRP-EGFP的荧光信号集中于收缩细胞的细胞膜上，而在细胞壁未见明显荧光信号，说明PQ-LRP蛋白定位于细胞膜。

PQ-LRP基因全长1 522 bp，含有一个1 080 bp的开放阅读框（翻译359个氨基酸）以及5′端非编码区（49 bp）和3′端非编码区（393 bp）。为使融合EGFP能准确报告PQ-LRP基因在犬小孢子菌中的定位，避免遗漏可能存在的定位信号，且不影响EGFP蛋白折叠，我们利用SacⅠ与BamHⅠ酶切位点将PQ-LRP基因片段连接至EGFP的C端（上游），使PQ-LRP基因片段的插入对EGFP的表达无影响，测序结果证实PQ-LRP与EGFP阅读框均无突变。

图5 激光共聚焦显微镜分析LRP-EGFP重组蛋白在犬小孢子菌细胞中的定位

PQ-LRP蛋白是一种双环状结构的膜绑定蛋白，在真菌中普遍存在且与真菌的生长生存有密切联系［9］。本研究组前期发现，犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰株大分生孢子大小不一，形状不规则，孢子壁皱褶破裂，分隔减少或缺如，细胞内容物不均匀，出现空泡甚至缺失，推测犬小孢子菌的细胞膜和细胞壁与PQ-LRP基因有密切联系，当外源性加入半胱氨酸时，野生株PQ-LRP基因表达水平随半胱氨酸浓度的增加呈上升趋势［5］，Xiao等［10］上调PQ-LRP基因表达量后发现半胱氨酸代谢水平随之提高，PQ-LRP可能通过影响半胱氨酸的合成代谢影响细胞壁主要成分几丁质的合成，使犬小孢子菌细胞壁结构受到破坏。我们猜测PQ-LRP蛋白不仅参与细胞膜和细胞壁成分的合成代谢，并且是犬小孢子菌细胞膜的重要组成部分。

本实验中，我们对犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的亚细胞定位进行初探，建立了一种适用于犬小孢子菌蛋白的GFP标记方法，无论是对犬小孢子菌其他蛋白质亚细胞定位的研究，还是对进一步探索PQLRP蛋白的结构及与其他蛋白质的相互作用机制等，均提供了理论依据。