益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠肾功能及足细胞的影响

应帅兵张伊娜邱华锋黄平

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.浙江中医药大学附属第二医院

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病的慢性微血管病变的主要并发症之一，可导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）、肾功能衰竭[1-2]，是糖尿病患者致死、致残的主要原因。肾小球脏层上皮细胞又称足细胞,是一种终末分化的多突状细胞，参与了肾小球毛细血管袢的稳定，在维持肾小球滤过屏障，调节超滤系数以及保持肾小球基底膜的正常形态中起重要作用。DN病理改变表现为肾小球基底膜增厚、足细胞足突广泛融合甚至消失、足突裂孔数量减少、系膜区细胞外基质的进行性积聚，这主要与肾小球内灌注压的增加、各种血管活性激素途径和氧化应激的激活、糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）诱导的病理改变、多元醇通路活化及细胞因子损伤等机制有关[3]。研究表明，足细胞形态学变化涉及到蛋白尿的发生以及肾脏疾病的发展[4]，因此保护足细胞对于控制DN病情以及防止疾病发展意义重大。

厄贝沙坦片为血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受体拮抗剂，临床上广泛用于合并高血压的2型糖尿病患者的治疗。研究证明，厄贝沙坦能显著抑制肾小球系膜基质的沉积，抑制足细胞数量减少，减轻肾小球足细胞和基底膜的病理变化，从而保护足细胞，减轻DN的肾功能损伤[5]。中医认为糖尿病属消渴病，主要病机是脾肾气阴两虚、瘀血阻滞，以本虚标实为主要特点，益气养阴、活血化瘀是DN最重要的治则之一，因此化瘀通络中药是DN的基础用药。益气养阴活血方是以益气养阴活血为治则制成的经验方[6]，既往临床研究表明，益气养阴活血方可以改善DN患者肾功能，减轻机体炎症反应，缓解肾损伤[7]，其作用机制与控制糖脂代谢、抑制肾脏纤维化、抗氧化有关[8]。尹娟娟等[9]研究提示，益气养阴活血方能够增加巨蛋白表达，但该方是否对肾组织足细胞形态学变化存在影响，尚未见文献报道。本研究以腹腔注射链脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）溶液的方法制备DN大鼠模型，以益气养阴活血方进行干预，同时以厄贝沙坦为阳性对照，观察大鼠肾功能指标及足细胞的形态变化，进一步探究益气养阴活血方对DN大鼠肾脏的保护作用靶点和机制，为益气养阴活血方的进一步推广应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 5周龄清洁级健康雄性SD大鼠32只，体质量（body weight,BW）为（200±20）g，购自上海斯莱克有限公司 [实验动物生产许可证：SCXK（沪）2017-0005]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠全封闭隔离饲养，室温20℃，相对湿度40%～60%，每日光照12h。

1.2 主要试剂与仪器 益气养阴活血方由黄芪20g、麦冬 15g、白术 12g、五味子 15g、知母 12g、山萸肉12g、桃仁 12g、红花 10g、茯苓 15g、玄参 15g、旱莲草15g、川芎12g、女贞子15g、葛根15g组成，以上药物均购于浙江中医药大学名中医馆，由浙江中医药大学中药饮片厂提供，水煎浓缩至5g·mL-1；厄贝沙坦片购于赛诺菲(杭州)制药有限公司（规格：150mg/片，国药准字：J20130049)，以无菌蒸馏水配置成2.5mg·mL-1的混悬液；STZ购于美国Sigma公司（批号：SLBB8126V），以0.1mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，调节pH至4.2～4.5，配成1%STZ溶液，使用时应现用现配，避免冰浴中操作；血清肌酐（serum creatinine,SCr）检测试剂盒、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（批号：20180314、20180321）。罗氏血糖仪为德国罗氏公司产品；7020全自动生化分析仪及H-7650日立透射电子显微镜均为日本日立公司产品。

1.3 方法

1.3.1 造模和分组 以普通饲料适应性喂养1周后，检测血糖阴性，按随机数字法将大鼠分为正常组8只和DN造模组24只。所有大鼠禁食12h后称重，DN造模组按60mg/kg剂量在大鼠腹腔左侧注射现配的1%STZ溶液。72h后经尾静脉采血检测各组大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）。DN大鼠造模依据文献[10]，以FBG≥16.7mmol·L-1为造模成功标准。对于未达标准的大鼠，1周后按50mg/kg剂量再次行STZ腹腔注射，经尾静脉采血复查血糖。本次DN造模组24只大鼠均一次造模成功。造模成功后将24只大鼠随机分为模型组、中药组和厄贝沙坦组，每组8只。

1.3.2 给药方法 造模成功后，各组大鼠均继续给予普通饲料喂养，其中中药组和厄贝沙坦组以60kg体重成人用量的10倍换算大鼠给药剂量[11]。换算结果如下：中药组大鼠以益气养阴活血方水煎液10mL/（kg·d）灌胃，相当于生药剂量 50g/kg·d；厄贝沙坦组以厄贝沙坦混悬液10mL/（kg·d）灌胃，相当于25mg/（kg·d）剂量；正常组和模型组予等体积的蒸馏水灌胃。实验期间各组大鼠按组分笼饲养，每天固定时间段进行灌胃操作，1次/d，共8周。期间所有大鼠均予普通饮食，自由饮水，未使用胰岛素及其他降血糖药物。实验中每隔1周称量大鼠BW并调整灌胃量。

1.3.3 标本采集 各组大鼠均于第8周末给药后禁食，自由饮水，12h后称量BW，以10%水合氯醛按0.3mL/100g剂量腹腔注射麻醉后，经腹主动脉收集血液标本，3 500r/min离心10min，分离血清用于检测SCr和BUN水平。分离大鼠左侧肾脏，于肾门处剪断肾蒂，快速剥离肾脏包膜后以滤纸吸干并称量肾脏质量（kidney weight，KW），计算肾脏指数（kidney index，KI）。称重后将肾脏对切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，加入戊二醇4℃固定4h以上，待行电镜检查。

1.4 指标检测

1.4.1 一般情况观察和KI计算 观察各组大鼠毛色、体重、饮食、体态、灵敏度和精神状况；第8周末称量BW和左侧肾脏KW，根据公式KI=KW（g）/BW（g）计算肾脏指数。

1.4.2 生化指标FBG、SCr、BUN检测 实验期间每2周末行尾静脉采血，用罗氏血糖仪测FBG，血糖＜16.7mmol·L-1者及时剔除。此次实验过程中所有DN造模组大鼠FBG检测均＞16.7mmol·L-1，按照试剂盒说明书操作，在全自动生化分析仪上测定SCr和BUN水平。

1.4.3 肾脏足细胞形态和基底膜厚度电镜观察 收集以3.75%戊二醇固定4h以上的大鼠肾脏标本，以0.1mol·L-1的 PBS 漂洗 5～6 次，丙酮脱水、浸透，然后石蜡包埋、切片。将厚80～90nm的切片置于铜网上，醋酸铀染液室温染15～30min，双蒸水洗净后，再置于柠檬酸铝染液中，室温染10～20min，双蒸水洗净，滤纸吸干，透射电镜下观察[12]。

1.5 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有数据先进行正态性检验和方差齐性检验，正态分布及满足方差齐性的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；不符合条件数据进行非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况、BW和KI比较 正常组大鼠精神状态良好，毛色光泽，进食正常，尿量正常，大便成麦粒状，BW增加较快。模型组大鼠均精神萎靡，反应迟钝，蜷卧拱背，毛发竖立无光泽、易脱落，伴有多饮、多食、多尿等症状，BW增长缓慢，大便较稀，次数多。中药组和厄贝沙坦组有类似表现，但程度有所减轻。

造模前各组大鼠BW无统计学差异（P＞0.05）。给药8周后，与正常组比较，模型组BW增长缓慢，KI明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药组与厄贝沙坦组BW增长较快，差异均有统计学意义（P＜0.01）；KW 则无统计学差异（P＞0.05），KI低于模型组（P＜0.01），中药组与厄贝沙坦组之间比较，KW、BW及KI均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BW及KI比较（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

表1 各组大鼠BW及KI比较（±s）Tab.1 Comparison of BW and KI in each group(±s)

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,**P＜0.01

组别 n K W（g） B W（g） K I正常组模型组中药组厄贝沙坦组8 8 8 8 1.8 8±0.1 5 2.0 7±0.2 6 1.9 8±0.2 7 2.0 4±0.0 4 4 1 8.3 3±1 8.7 6 3 2 2.5 0±1 2.6 6△△3 4 2.3 9±1 4.2 6△△**3 6 7.5 5±1 4.5 1△△**0.0 0 4 5±0.0 0 0 1 0.0 0 6 4±0.0 0 0 8△△0.0 0 5 8±0.0 0 0 2△△**0.0 0 5 2±0.0 0 0 2△△**

2.2 各组大鼠FBG、SCr、BUN比较 给药前及给药8周后，与正常组比较，模型组、中药组和厄贝沙坦组的FBG水平均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；而厄贝沙坦组和中药组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，模型组、中药组和厄贝沙坦组大鼠 SCr、BUN 水平增高（P＜0.01）；与模型组比较，中药组和厄贝沙坦组上述指标均明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；中药组和厄贝沙坦组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肾脏组织超微结构比较 正常组大鼠毛细血管基底膜厚度均匀一致，均在正常范围内，无电子致密物沉积，足细胞排列整齐，足突规则清楚，无广泛融合。模型组基底膜明显增厚，基底膜内可见电子致密物沉积，足细胞排列紊乱且足突融合，裂孔数目明显减少，足细胞胞质线粒体明显减少，线粒体嵴出现断裂、脂滴沉积和空泡变性。与模型组比较，中药组毛细血管基底膜增厚减轻，足细胞排列相对整齐，足突部分融合，足细胞损伤较小；厄贝沙坦组足突增宽，排列整齐，少数有融合，足细胞内线粒体损伤较模型组减轻。见图1。

电镜下测量各组基底膜厚度发现，与正常组比较，模型组和厄贝沙坦组基底膜增厚，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），而中药组基底膜厚度则无统计学差异（P＞0.05）。与模型组比较，厄贝沙坦组与中药组基底膜较薄（P＜0.01），中药组基底膜薄于厄贝沙坦组（P＜0.05）。见图 2。

表2 各组大鼠FBG、SCr及BUN比较（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

表2 各组大鼠FBG、SCr及BUN比较（±s）Tab.2 Comparison of FBG,SCr and BUN in each group(±s)

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01Note:Compared with normal group,△△P＜0.01;compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01

组别n给药前F B G（m m o l·L-1）给药第8周F B G（m m o l·L-1）S C r（μ m o l·L-1）B U N（m m o l·L-1）正常组模型组中药组厄贝沙坦组8 8 8 8 5.1 8±0.7 7 1 7.5 5±1.1 3△△1 7.7 9±1.1 3△△1 7.9 5±1.1 4△△5.0 3±1.0 8 2 7.5 8±1.8 6△△1 8.4 0±1.7 2△△**1 9.2 8±1.8 6△△**3 5.4 0±3.2 6 7 1.2 5±7.4 4△△4 8.1 6±6.3 1△△**5 2.7 8±6.2 4△△**3.6 5±0.5 6 1 3.0 6±2.7 9△△1 0.5 5±1.3 2△△**1 1.1 3±1.5 2△△*

3 讨论

足细胞是肾小球滤过屏障的主要组成部分，完整的结构和足够的数量是保证肾小球滤过膜正常运行的基础。研究证明，足细胞结构异常、数量减少及相关分子表达变化致使肾小球滤过屏障通透性增加，从而导致蛋白尿的产生，进一步引起肾小球硬化、肾功能进行性丧失等病变，与DN的发生与发展密切相关[13]。张秀丽等[14]研究发现，足细胞病变与糖尿病大鼠血流动力学的改变有关。细胞因子损伤、氧化应激、代谢紊乱等是足细胞病变的影响因素。熊何健等[15]研究显示，高糖可通过活性氧自由基启动足细胞凋亡，诱导其从基底膜上脱落，进而引起蛋白质漏出，导致蛋白尿。

图1 各组大鼠肾脏足细胞超微结构比较（20 000×）Fig.1 Comparison of podocyte ultrastructure in each group(20 000×)

图2 各组大鼠肾小球基底膜厚度比较Fig.2 Comparison of basement membrane thickness in each group

目前DN尚缺乏特效的治疗方法，中医认为DN是在消渴的基础上发展而来，属于本虚标实之证，以脾肾气阴两虚为本，以血瘀阻滞为标，病变部位在络脉，以补气益肾、化瘀通络为治则。研究证实，益气养阴活血方对DN大鼠24h尿蛋白定量、血脂、SCr、尿β2微球蛋白水平等均有改善作用[6]。李中南等[16]研究发现，具有益气养阴活血作用的丹蛭降糖胶囊能够明显减轻DN大鼠的足细胞损伤。本研究通过观察益气养阴活血方对DN大鼠血糖、肾功能以及肾脏足细胞的影响，研究中药治疗DN的方法。结果显示，益气养阴活血方能够有效降低DN大鼠FBG，改善肾功能。笔者推断益气养阴活血方可能通过减轻足细胞损伤，从而延缓肾脏病变过程，提示本方对DN早期肾脏病变有改善作用。本研究中模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜明显增厚，伴有电子致密物沉积，足细胞损伤主要表现为数量减少、形态异常、足突紊乱融合，导致滤过膜完整性受损；而足细胞内线粒体减少，可见脂质沉积，提示DN状态下足细胞结构异常，与文献报道一致。中药组足细胞损伤减轻，提示益气养阴活血方能够保护足细胞，且改善程度优于厄贝沙坦组。

进一步分析益气养阴活血方作用机制，方中黄芪、山萸肉为君药，益气固本、滋补肝肾；臣药茯苓、白术益气健脾，协助黄芪益气；葛根、麦冬生津养阴；五味子、女贞子、旱莲草协助山萸肉滋补肝肾、固肾涩精；佐使药红花、桃仁、川芎活血化瘀，补而不留邪，祛邪而不伤正；知母、玄参寓泄于补，以泄助补，使药性平和。全方标本兼治，共奏益气养阴之效。李志杰等[17]研究表明，黄芪单体可提高早期DN大鼠足细胞的nephrin和podocin蛋白表达水平，从而延缓DN的病理进展。红花黄色素具有减低早期DN患者血清炎症因子表达，抑制细胞凋亡，减少肾脏氧化应激等作用[18-19]。山萸肉预防肾脏病变的机制主要是改善氧化应激，抑制AGEs形成[20]。还有研究证实，血管内皮生长因子可损伤肾小管内皮细胞和系膜区[21]，张伊娜等[22]研究发现，益气养阴活血方可抑制血管内皮生长因子的表达，故降低血管内皮生长因子表达，可能也是该方保护足细胞的机制之一。

综上所述，本研究进一步证明益气养阴活血方可以通过减轻足细胞损伤起到保护肾脏功能的作用，从而治疗DN，且作用与厄贝沙坦无显著差异，为该方进一步临床应用提供了实验依据。笔者推断益气养阴活血方可能通过降低炎症因子水平、抗氧化、影响足细胞蛋白表达、降低血管内皮生长因子表达等多途径保护肾小球足细胞，其是否影响足细胞相关的其他蛋白表达尚有待进一步研究。