大鼠腰椎间盘突出症造模前后大脑静息态功能磁共振局部一致性变化研究

张燕鹏，梁钟鸣，张传寅

(上海市宝山区仁和医院(复旦大学附属华山北院宝山分院) 骨科，上海 201900)

腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation，LDH)是指腰椎间盘发生退行性改变后，纤维环部分或全部破裂、单独或者连同髓核、软骨终板向外突出，刺激或压迫窦椎神经和神经根引起的腰腿痛为主要症状的一种病变[1]。它是骨科一种常见的临床疾病，也是引起腰腿痛的最常见原因。既往研究表明，周围神经受到损害时，大脑的功能和结构都可能发生相应的变化[2,3]。尤其与神经痛相关性脑功能变化也与疼痛的时间和程度具有相关性[4-7]。同时，除了与周围神经损害直接相关的感觉运动区，与疼痛、记忆、情绪等相关的脑区，如内侧前额叶(mPFC)、前扣带回(ACC)和岛叶皮质(Insular cortices)等也会发生改变[8,9]。目前已有一些对于LDH的脑功能研究[10-14]，但主要集中在LDH病人与健康人的对比，以及针灸、推拿等非侵入式干预方法对脑功能的影响。本研究建立LDH的大鼠模型，通过行为学检测、小动物fMRI方法，对比在LDH造模前后的行为学和静息态fMRI指标变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

雄性健康SD大鼠16只，体重200-250 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养条件：明暗光照12 小时周期循环，常规食物、饮水供应，室温控制在18℃，湿度40%-50%。所有的实验均在研究开始前通过复旦大学附属华山医院宝山分院伦理委员会批准。

大鼠适应性喂养1周后，随机等分组为2组：LDH组(n=8)和假手术组(n=8)。

1.2 造模方法

1.2.1腰椎间盘突出症(LDH组) 实验组以背部L5/L6椎间隙为中心，做背部正中纵形切口，依次切开皮肤、皮下组织及腰背筋膜，沿棘突左侧剥离骶棘肌，并向左侧分开，显露左侧L5、L6椎板，咬除L5、L6左侧椎板、关节突和部分椎弓根，显露左侧硬脊膜及L5、L6的左侧神经根、神经节。再在大鼠尾腹侧近根部纵行切开皮肤、皮下组织至尾椎骨面，向两侧分离显露两个椎间隙，取出两段髓核组织并分别移植到L5、L6神经根处，逐层缝合伤口，送至动物房正常饲养[15-18]。

1.2.2假手术组(Sham组) 假手术组大鼠单纯暴露L5、L6神经根，切除尾椎髓核后，逐层缝合伤口，送至同等环境下饲养。

1.3 行为学检测方法

分别在造模前1天和造模后2、7、14、28天检测大鼠左侧(患侧)后肢的机械性痛阈、热痛阈和步态分析。

1.3.1机械性痛阈检测 采用Von-Frey纤维丝(美国Stoelting公司)，垂直刺激大鼠左后肢足底。渐加压使纤维成为“S”形,持续6-8 s，观察大鼠是否出现缩足反应。若大鼠在刺激时或移开von Frey 纤维时立刻出现快速的缩足反应，即为阳性反应。出现阳性50%以上则定为对机械刺激的痛反射阈值(g)。

1.3.2热痛阈检测 热痛阈用于评估温度觉，采用热痛仪(PL-200，II TC/life Science公司，USA)检测。其结果为从开始热刺激到大鼠缩足的时间，即大鼠热缩足反应潜伏期(s)，进行量化分析，评估感觉神经功能。

1.3.3双足平衡试验 采用PH-200双足平衡测试系统(成都泰盟科技有限公司)检测大鼠平静状态下双侧后足的负重情况。记录双侧后肢的负重差。

1.4 小动物fMRI扫描方法

采用德国Bruker 7.0 T磁共振系统小动物专用线圈，在造模前1天和造模后28天分别进行一次静息态大脑fMRI扫描。大鼠4%异氟烷气麻后固定在MRI扫描仪，2%异氟烷维持麻醉，给予呼吸机支持和呼吸监测。首先扫描T2加权像序列以进行解剖定位，具体参数为：TR=4000 ms，TE=18 ms，平均次数2，翻转角为90°，FOV=10×10 mm2，层厚为=3 mm。静息态fMRI采用隔层扫描的单激发平面回波序列(Echo planar imaging，EPI)，翻转角=90°，扫描层厚=3 mm，平均次数1，层数60层，TR=3000 ms，TE=20 ms，FOV=32×32 mm2。

数据处理和分析采用Matlab 2013a环境下的Statistical Parametric Mapping 8(SPM8)软件包(http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/)。在开始处理时，图像进行十倍放大，使其尺寸近似人类的大脑，以便于使用原本为人类研究开发的数据处理算法。

预处理包括以下7个步骤：①剥除非脑组织；②时间层校正；③头动校正；④空间标准化；⑤去线性漂移；⑥滤波(0.01-0.08Hz)；⑦去除协变量，包括头动参数、全局平均信号、白质和脑脊液信号。

局部一致性(Regional homogeneity，ReHo)的计算：ReHo用于分析局部脑活动的特性，该方法是利用肯德尔和谐系数(Kendall coefficient of concordance，KCC)来评价一个体素与相邻体素脑活动的一致性[19]。ReHo 分析采用未进行高斯平滑的数据。运用北京师范大学研发的脑功能数据处理软件REST计算出各个体素的KCC，即为各个体素的ReHo值。ReHo值越大，提示给定体素的静息状态时间序列与其周围的26个体素的时间序列具有较高的区域同步性。全脑每个体素的ReHo值构成了个体ReHo脑图。把每一个体素KCC值除以全脑平均KCC值得到个体的平均ReHo图像。然后对平均ReHo脑图进行高斯平滑(平滑核为体素大小两倍)。

1.5 统计方法

1.5.1行为学统计方法 行为学数据采用SPSS 22.0统计软件分析，数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，组间数据比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验。P<0.05认为有统计学差异。

1.5.2fMRI统计方法 fMRI数据采用SPM8进行统计分析。为了确定每个时间点2组之间的差异，对同一组的两个时间点之间比较进行双样本t检验。采用FDR(False Discovery Rate)校正(P<0.05)。

2 结果

2.1 行为学检测结果

2.1.1机械性痛阈 造模前LDH组和Sham组左侧(患侧)后足机械性痛阈无显著差异。造模后2天开始LDH组机械性痛阈较造模前显著下降(P<0.05)，一直持续到造模后28天；Sham组造模后机械性痛阈稍有下降，但与造模前比没有显著差异(P>0.05)(图1)。

图1 腰椎间盘突出症组与假手术组大鼠造模前与造模后2、7、14、28天左后足机械性痛阈变化情况(*表示与该组造模前比差异有统计学意义，P<0.05)

2.1.2热痛阈 造模前LDH组和Sham组左侧(患侧)后足热痛阈无显著差异。造模后2天开始LDH组热痛阈较造模前显著下降(P<0.05)，一直持续到造模后28天；Sham组造模后热痛阈稍有下降，但与造模前比没有显著差异(P>0.05)(图2)。

2.1.3双足平衡试验 造模前LDH组和Sham组双后足负重差无显著差异。造模后2天开始LDH组双后足负重差较造模前显著增加(P<0.05)，一直持续到造模后28天；Sham组造模后双足负重差稍有增加，但与造模前比没有显著差异(P>0.05)(图3)。

2.2 小动物fMRI结果

术后28天LDH组大鼠右侧大脑半球体感皮质、运动皮质等感觉运动整合相关脑区ReHo较造模前显著降低；右侧丘脑背外侧、左侧海马背外侧ReHo值显著增加(P<0.05，FDR校正，cluster size≥10)(图4)。术后28天Sham组大鼠ReHo值未发生显著改变。

图2 腰椎间盘突出症组与假手术组大鼠造模前与造模后2、7、14、28天左后足热痛阈变化情况(*表示与该组造模前比差异有统计学意义，P<0.05)

图3 腰椎间盘突出症组与假手术组大鼠造模前与造模后2、7、14、28天双足负重差变化情况(*表示与该组造模前比差异有统计学意义，P<0.05)

图4 腰椎间盘突出症组(LDH组)大鼠造模后28天与造模前相比局部一致性(ReHo)变化情况

3 讨论

腰椎间盘突出症所致腰腿痛是骨科最常见的疾病之一，近年来不仅中老年人，很多年轻人也罹患此病，其发病率占椎管疾病的第一位。手术治疗是较彻底的干预手段，但仍有部分患者术后症状未完全缓解。目前认为，周围和中枢神经为一个整体，周围神经损伤，如卡压、挫伤、完全或部分断裂等，会引起大脑功能甚至结构的改变。因此，研究LDH发生过程中大脑功能状态对于全面了解LDH对中枢神经系统的影响具有重要价值。

功能磁共振(fMRI)是研究脑功能的重要无创、非侵入式工具之一，它可以动态检测个体干预前后大脑的微小变化[20,21]。ReHo是一种基于静息状态fMRI数据的分析方法[19]，采用KCC为指标来度量一个团块(常为27个体素)内一个体素与其相邻体素之间低频振幅的时域同步性。fMRI也用于多项LDH临床研究[10-14]。张川等发现，LDH所致疼痛引起广泛的脑功能区低频振幅(ALFF)异常，包括疼痛、感觉、运动、情绪、记忆、认知等，并与疼痛程度呈正相关[10]。刘宜军等也将fMRI用于LDH的脑功能研究，发现针刺、手法治疗的镇痛效应相关的静息态脑功能变化[11,12,14,22,23]。但这些研究多为患者和健康人之间的对比，而较难进行LDH发生、发展过程中脑功能变化；且基于不同被试组之间的比较，混杂因素较多，结果的可靠性可能受到影响。随着技术的发展，尤其是高场强MRI和小动物专用线圈的出现，我们有可能对动物的脑功能进行动态检测。

本研究对大鼠在L5/L6腰椎间盘突出症造模前后的行为学和脑功能进行动态检测(LDH组)，设置假手术组(Sham组)进行对照。行为学检测结果显示， LDH组大鼠左侧后足机械性痛阈和热痛阈显著下降，双后足的负重差显著升高、且右侧(健侧)负重大于左侧(患侧)，显示LDH造模成功。

本研究中静息态磁共振检测显示，LDH组大鼠造模后多个脑区的ReHo值发生改变，包括右侧大脑半球(患肢对侧)的感觉运动相关脑区，如体感皮质、运动皮质等的ReHo较造模前显著降低。这与周围神经卡压的模型相似。既往对腕管综合征(腕部正中神经卡压)的fMRI研究提示，腕管综合征患者对侧半球初级感觉运动皮质的正中神经代表区出现比正常对照组激活范围更大，且示、中指初级感觉区(S1)比正常对照组激活范围更大、距离更接近[24]。在感觉刺激任务中，腕管综合征患者患肢对侧初级感觉区(S1)和双侧刺激感觉区(S2)、初级运动区(M1)、运动前区(PMC)、岛叶皮质(Insular cortex)激活范围更大、重叠更多[25]。在周围神经卡压时，神经的传入和传出都受阻，患肢所对应的感觉运动功能区内部联系减弱，相应感觉运动功能区的完整性受损。

此外，本研究还显示LDH组右侧背外侧丘脑、左侧海马背外侧ReHo值较造模前显著增加。丘脑是重要的感觉传导接替站，并与基底神经节、小脑、新皮质以及内侧颞叶建立双向的信息传导。来自全身各种感觉的传导通路，均在丘脑内更换神经元，然后投射到大脑皮质。海马(Hippocampus)主要负责学习和记忆。当大脑皮质中的神经元接收到感知信息时，会把信息传递到海马，开始形成持久的网络，大脑通过这种形式保存记忆和经验。丘脑与海马ReHo值增加表明与疼痛信息传导、感觉记忆的相关区域局部同步性增强，功能一致性增加。因此，我们推测，丘脑和海马ReHo值改变与神经根受刺激引起的疼痛信号，局部效应汇集，发生相互作用所致。

综上所述，通过ReHo值能够研究与感觉和疼痛相关脑区神经活动的局部同步性发生改变，这为我们进一步动态研究LDH作用机制和前后变化提供了重要帮助。