长链非编码RNA HOTAIR靶向miR-1对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

董孟宁， 张建党，张元峰，韩伟一

(南阳市中心医院 神经外科，河南 南阳473009)

胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，具有较高的癌细胞转移率和致死率。据报道，经常规治疗的胶质瘤患者生存时间中位数仅有15个月[1]。因此探究胶质瘤发生发展机制，寻找治疗胶质瘤的新方法显得尤为迫切。长链非编码RNA是一类在哺乳动物体内高度保守的RNA，不参与蛋白质的编码，但能通过调控基因的表达过程影响疾病的发生发展，如影响基因转录、翻译后修饰及调控表观遗传等[2]。研究发现LncRNAs在多类疾病中均出现表达异常，特别是癌症[3,4]。大量研究表明，LncRNAs在胶质瘤中表达也有不同程度的升高和降低，如LncRNA CCAT1在胶质瘤细胞中表达升高，能通过靶向抑制微小型RNA-410(microRNA-410,miR-410) 的表达促进胶质瘤细胞增殖[5]。LncRNA GRNDE在胶质瘤细胞中表达增多，能通过调控mTOR信号通路促进胶质瘤细胞生长和侵袭[6]。也有研究表明，LncRNA HOTAIR在胶质瘤中表达升高，与胶质瘤患者的存活时间及预后密切相关，可作为胶质瘤生物标记物[7,8]。HOTAIR可通过靶向调控miR-326的表达影响胶质瘤细胞的生长[1]。miR-1是一类抑癌基因，在胶质瘤中呈低表达水平，Su DN等人研究发现，HOTAIR能通过负向调控miR-1的表达促进肝癌的发展[9]，但HOTAIR是否能通过靶向调控miR-1的表达影响胶质瘤细胞的生存及侵袭转移能力还未见报道。本文通过沉默HOTAIR的表达，探究HOTAIR对胶质瘤细胞生存、侵袭及迁移的影响及机制，为HOTAIR应用于临床胶质瘤的预防及治疗提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人胶质瘤细胞株U87、U251、U118和LN18购自美国典型培养物保藏中心 (American type culture collection,ATCC)。RPMI 1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，青霉素和链霉素购自美国BI公司。Trizol试剂、RIPA裂解液和BCA试剂盒购自北京索莱宝生物公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒、逆转录试剂盒、荧光素酶报告检测试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司。shRNA HOTAIR (sh-HOTAIR) 和miR-1 inhibitor购自上海吉满生物科技公司，实验所用引物采用Primer 3网站设计，由上海生工合成。Ki67、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2,MMP-2) 和MMP-9购自美国Santa Cruz公司，实验所有二抗购自上海博士德生物科技公司。

1.2 细胞培养

用含有10%胎牛血清，100 μg/mL的链霉素和100 U/mL的RPMI 1640培养液培养人胶质瘤细胞株U87、U251、U118和LN18，培养环境条件为37 ℃、5% CO2，隔天进行换液，细胞融合率达到85%以上时进行传代，传代浓度为1×104个/mL。

1.3 细胞分组及转染

将细胞分为Control组、sh-HOTAIR组、miR-1 inhibitor组和sh-HOTAIR + inhibitor组，将细胞接种于6孔板中，种板浓度为1×105个/mL。培养24 h后，根据转染试剂盒说明书用sh-HOTAIR转染sh-HOTAIR组细胞，miR-1 inhibitor转染miR-1 inhibitor组细胞，用sh-HOTAIR和miR-1 inhibitor同时转染sh-HOTAIR + inhibitor组细胞，Control组则加入等量载体进行处理。转染6 h后更换为正常细胞培养液继续培养，进行后续检测。

1.4 RT-PCR检测HOTAIR和miR-1的表达

用Trizol试剂提取胶质细胞株U87、U251、U118和LN18及用sh-HOTAIR处理后的U251细胞的总RNA进行定量分析后，每组取等量的RNA根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，用PCR仪进行扩增后，采用实时定量PCR试剂盒对其进行定量分析。

1.5 荧光素酶报告实验

通过生物信息预测HOTAIR和miR-1的结合片段，采用PCR进行扩增并插入到荧光素酶报告酶载体中，构建HOTAIR 野生型 (wt) 质粒；采用基因突变技术对HOTAIR序列上与miR-1的结合位点的个别核苷酸进行突变 ，构建HOTAIR突变型 (mut) 质粒。用miR-1 mimic和HOTAIR wt或HOTAIR mut共同转染U251细胞，24 h后检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.6 CCK8检测细胞活性

按照1.3所描述的方法转染各组细胞，转染后分别培养0 d、1 d、2 d、3 d和4 d根据CCK8试剂盒说明书每孔分别加入10 μl的CCK8溶液，37 ℃孵育3 h后于450 nm处检测各组细胞吸光度，计算细胞的增殖生长倍数。

1.7 流式检测细胞凋亡

将细胞按照1.3所描述的方法进行处理后，用胰蛋白酶消化收集细胞，用预冷的冷酸盐缓冲液清洗3次后，用结合缓冲液将细胞密度调整至1×106个/mL，取100 μl细胞悬液加入到试管中，并加入5 μl的Annexin V和10 μl的PI溶液，室温避光孵育15 min后用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.8 Transwell检测细胞侵袭能力

实验前将Matrigel放于4 ℃融化，融化后取少量Matrigel加入到Transwell小室中进行预包被，并尽量避免气泡产生。将细胞接种于Transwell小室内，按照1.3的方法进行分组后转染，用无血清培养液继续培养。24 h后用棉签擦去上层未迁移的细胞，用HE染色液将下层迁移细胞染色并进行计数统计。

1.9 划痕实验检测细胞迁移能力

实验前用记号笔于12孔板背面划线，使至少有5条线穿过每个培养孔。将细胞接种于12孔板中，并进行分组转染。转染后用10 μl的枪头垂直于背面直线划痕，用磷酸盐缓冲液洗去被刮下的细胞，换用无血清培养液继续培养。记录0 h和24 h的划痕宽度，计算划痕闭合率[划痕闭合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%]。

1.10 免疫印迹检测相关蛋白表达

将细胞进行转染后，用裂解液提取各组细胞蛋白，用BCA试剂盒进行定量分析后，调平各组细胞蛋白浓度。每组分别取30 μg蛋白质用10% SDS-PAGE分离各组蛋白，用半干法将蛋白质转移到PVDF膜并加入5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，之后加入适应浓度一抗于4 ℃孵育过夜，第二天洗去未结合一抗，加入二抗于37 ℃孵育1 h后，滴加化学发光显色液进行曝光显色。以GAPDH为内参。

1.11 统计学分析

本文所有实验数据均用统计软件SPSS 17.0进行分析。先对实验数据进行正态分布和方差齐性分析，符合条件者采用单因素方差分析或t检验，不符合条件则采用秩和检验。

2 结果

2.1 sh-HOTAIR促进miR-1表达

如图1所示，HOTAIR在多类胶质瘤细胞株中的表达水平以U251细胞最高，因此选择U251细胞进行后续实验。用sh-HOTAIR转染细胞后发现，sh-HOTAIR能显著降低U251细胞HOTAIR的表达水平 (P<0.001，图2)，并显著升高miR-1的表达水平 (P<0.001，图2)，表明HOTAIR能抑制miR-1的表达。

图1 HOTAIR在胶质瘤细胞株中的表达

图2 sh-HOTAIR对U251细胞HOTAIR和miR-1

2.2 HOTAIR与miR-1的靶向关系

生物信息预测结果表明，miR-1序列上存在HOTAIR的结合位点。同时，miR-1 mimic能显著升高U251细胞miR-1的表达水平 (P<0.001，图3)，并且还能降低HOTAIR野生质粒的荧光素酶活性 (P<0.001，图3)，将结合位点核苷酸进行突变后，miR-1 mimic对HOTAIR质粒荧光素酶活性的抑制作用消失，提示HOTAIR能靶向结合miR-1。

图3 HOTAIR与miR-1的靶向关系

2.3 sh-HOTAIR抑制U251细胞增殖

与Control组比较，sh-HOTAIR组细胞生长倍数明显降低 (P<0.001，图4)，miR-1 inhibitor组细胞生长倍数明显升高 (P<0.01，图4)，差异有统计学意义；与sh-HOTAIR组比较，sh-HOTAIR + inhibitor组细胞生长速度明显升高(P<0.001，图4)，差异有统计学意义。同时，sh-HOTAIR组细胞增殖相关蛋白Ki67的表达水平与Control组比较明显降低 (P<0.001，图8)，miR-1 inhibitor组Ki67表达水平明显高于Control组 (P<0.001，图8)；sh-HOTAIR + inhibitor组Ki67表达水平与sh-HOTAIR组比较明显升高 (P<0.01，图8)，差异有统计学意义，表明sh-HOTAIR能通过诱导miR-1表达抑制U251细胞增殖。

图4 sh-HOTAIR对U251细胞增殖的影响

2.4 sh-HOTAIR诱导U251细胞凋亡

如图5所示，与Control组比较，sh-HOTAIR组细胞凋亡率明显升高 (P<0.001，图5)，miR-1 inhibitor组细胞凋亡率明显降低 (P<0.01，图5)；与sh-HOTAIR组比较，sh-HOTAIR + inhibitor组细胞凋亡率明显升高 (P<0.001，图5)，差异有统计学意义；此外，sh-HOTAIR能显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达 (P<0.001，图8)，诱导促凋亡因子Bax表达 (P<0.001，图8)，miR-1 inhibitor能显著升高Bcl-2的表达水平 (P<0.01，图8)，降低Bax的表达水平(P<0.01，图8)；miR-1 inhibitor还能显著减弱sh-HOTAIR对Bcl-2和Bax表达的调控作用 (P<0.01，图8)，表明sh-HOTAIR能通过促进miR-1表达诱导U251细胞凋亡。

2.5 sh-HOTAIR抑制U251细胞侵袭

与Control组比较，sh-HOTAIR组侵袭细胞数明显减少(P<0.001，图6)，miR-1 inhibitor组侵袭细胞明显增多(P<0.01，图6)；与sh-HOTAIR组比较，sh-HOTAIR + inhibitor组侵袭细胞明显增多 (P<0.01，图6)，表明sh-HOTAIR能通过诱导miR-1表达降低U251细胞侵袭能力。

2.6 sh-HOTAIR抑制U251细胞迁移

与Control组比较，sh-HOTAIR组细胞划痕闭合率明显降低 (P<0.001，图7)；与sh-HOTAIR组比较，sh-HOTAIR + inhibitor组细胞划痕闭合率显著升高(P<0.01，图7)，差异有统计学意义。同时，sh-HOTAIR能显著抑制U251细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达 (P<0.001，图8)，miR-1 inhibitor能显著促进MMP-2和MMP-9的表达 (P<0.01，图8)，miR-1 inhibitor还能显著减弱sh-HOTAIR对MMP-2和MMP-9表达的促进作用 (P<0.01，图8)，提示sh-HOTAIR能通过抑制miR-1的表达抑制U251细胞迁移。

图5 sh-HOTAIR对U251细胞凋亡的影响

图6 sh-HOTAIR对U251细胞侵袭的影响

图7 sh-HOTAIR对U251细胞迁移的影响

图8 sh-HOTAIR对Ki67、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9表达的影响

3 讨论

目前大量研究表明，LncRNA的异常表达不仅能影响真核细胞基因的表达，同时还能促进疾病的发生发展，能通过调控细胞增殖使细胞获得无限增殖的能力，导致癌症的发生，同时还能促进癌症转移，诱导癌症恶化[10,11]。HOTAIR是一类致癌基因，于2010年首次被报道其与乳腺癌患者癌症的转移相关[12]。随后大量研究报道表明HOTAIR在其他各类癌症中均表现为高表达状态，并且与癌症的发生有着密切关系[13,14]。也有大量研究表明，HOTAIR在胶质瘤细胞及患者的肿瘤组织中表达均明显增多，并与胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移有关[15]。但具体作用机制有待进一步探究。本研究首先检测了HOTAIR在几类胶质瘤细胞株中的表达情况并发现，HOTAIR在U251细胞中表达水平最高，因此选择U251细胞进行后续实验。

miR-1是一类在多种癌症中低表达的miRNA，在胶质瘤发生发展过程中起到负向调控的作用[16]。上调miR-1的表达能通过调控表皮生长因子受体抑制胶质瘤细胞的迁移，从而减缓胶质瘤患者病情的恶化[17]。本文研究结果表明下调HOTAIR的表达能显著升高miR-1在U251细胞中的表达水平，提示HOTAIR可能抑制miR-1的表达。生物信息预测结果表明，miR-1基因序列上存在连续的HOTAIR的结合位点。此外，荧光素酶报告实验结果发现，miR-1 mimic能显著减弱HOTAIR荧光素酶的活性，将HOTAIR序列上的个别结合位点突变后miR-1 mimic抑制荧光素酶活性的抑制作用消失，进一步证明HOTAIR能靶向抑制miR-1的表达。

细胞无限增殖是癌症的主要特征之一，抑制癌细胞增殖也是目前临床放化疗治疗癌症的主要作用机制。研究表明，抑制HOTAIR的表达能抑制多种癌细胞的增殖，作用机制与调控miRNAs的表达有关。LIU SH等人在对胃癌的研究中发现，HOTAIR能通过靶向抑制miR-331-3p的表达促进人类表皮生长因子受体2表达促进胃癌肿瘤的生长[18]。HOTAIR还能通过靶向抑制miR-1的表达调控食道鳞状细胞癌细胞周期，从而促进癌细胞增殖[19]。Di W等人研究表明，HOTAIR能通过调控miR-1-CCND信号轴促进甲状腺癌细胞的生长、抑制癌细胞凋亡[20]。本文研究发现，用sh-HOTAIR沉默HOTAIR的表达后，U251细胞的增殖速度和增殖相关蛋白Ki67的表达水平明显降低，细胞凋亡水平明显升高；用miR-1 inhibitor进一步抑制miR-1表达后细胞增殖速度明显升高，细胞凋亡率明显降低，并且还能显著减弱sh-HOTAIR对细胞增殖及Ki67表达的调控作用。此外，sh-HOTAIR还能抑制Bcl-2表达，促进Bax表达。Bcl-2是一类抗凋亡蛋白，在多种肿瘤组织中呈高表达状态，能通过抑制Bax表达促进细胞存活[21]。结合实验结果表明sh-HOTAIR能通过上调miR-1的表达抑制U251细胞存活，提示HOTAIR能通过靶向抑制miR-1表达促进胶质瘤U251细胞生长。

癌细胞的侵袭和迁移是癌症转移的主要过程，血管周围侵袭性生长也是胶质瘤细胞增殖的主要方式，因此抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移是治疗胶质瘤的关键[22]。研究表明，HOTAIR在癌症中的高表达与癌症的转移密切相关，抑制HOTAIR表达有利于减缓癌症的发展[23]。研究发现，HOTAIR能促进卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移[24]，还能通过靶向下调miR-1在肝癌中的表达抑制肝癌细胞的生长、侵袭和迁移[9]。本文实验结果表明，沉默HOTAIR的表达能抑制U251细胞侵袭和迁移，miR-1 inhibitor能显著减弱sh-HOTAIR对U251细胞侵袭和迁移的抑制作用，表明sh-HOTAIR抑制胶质瘤U251细胞侵袭和迁移的作用与调控miR-1的表达有关。此外，sh-HOTAIR还能显著抑制MMP-2和MMP-9的表达，抑制miR-1表达能减弱sh-HOTAIR对MMP-2和MMP-9的调控作用。MMP-2和MMP-9是细胞侵袭和迁移的关键蛋白，能通过促进细胞外基质的降解增加癌细胞的运动能力，从而促进癌细胞的转移[25]。进一步表明HOTAIR能通过靶向抑制miR-1的表达促进胶质瘤U251细胞侵袭和迁移。

综上所述，sh-HOTAIR能抑制胶质瘤U251细胞增殖及Ki67表达、诱导细胞凋亡及Bax表达并降低Bcl-2的表达水平，miR-1inhibitor能显著降低sh-HOTAIR对细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的调控作用；同时，sh-HOTAIR还能减少U251细胞侵袭，抑制细胞迁移及MMP-2和MMP-9表达，miR-1inhibitor能显著减弱sh-HOTAIR对胶质瘤细胞侵袭和迁移的调控作用。提示HOTAIR能通过靶向miR-1促进胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移，为HOTAIR应用于临床胶质瘤的诊断及治疗提供了理论依据。