自噬吞噬对miR-155调控结肠癌细胞存活和凋亡的影响

李 涛，宛迎春，周长玉*，苏子源

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.长春中医药大学附属医院)

全球平均每年有100万人被诊断出患有结直肠癌[12]，结直肠癌存在的类型多样，约40%的病例携带KRAS突变，10%为BRAF突变[3]。与野生型KRAS患者相比，突变的KRAS预示着不良的预后和生存，同时耐受抗表皮生长因子受体(EGFR)治疗[4-6]。成熟的microRNAs (miRNAs)是内源性转录调节RNA分子，长度仅有18-25 bp，与目标mRNA 3’UTR相结合，负向调节其翻译[7]。miRNAs已被广泛证实可以调控基础细胞过程，如增殖，分化，发育，细胞凋亡和细胞周期[8]。本课题拟通过体外实验明确自体吞噬在miR-155诱导结肠癌细胞死亡和凋亡中的作用，为临床治疗结肠癌提供新的策略和理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人结肠癌HCT116，SW480，HT-29细胞和人结肠上皮细胞NCM460购买于中国科学院细胞库。细胞培养用胎牛血清FBS和DMEM高糖培养液购买于美国GIBCO公司，1640培养液和细胞消化用胰酶购买于美国Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和对照购买自上海吉玛制药技术有限公司，自噬抑制剂3-MA购买自美国Sigma公司，LC3和Cleaved caspase-3抗体购买自美国CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol试剂方法提取细胞中总RNA，提取总RNA后利用TaqMan进行实时逆转录聚合酶反应(RT-PCR)，miR-155所用引物和内源性对照U6购买自上海吉玛制药技术有限公司，利用ABI 7300检测系统对结果进行检测。

1.3 细胞转染

利用lipofectamine3000进行细胞转染，细胞培养至80%进行细胞转染，将细胞培养液换成Opti-MEM培养液，利用Opti-MEM稀释lip3000和DNA，同时在DNA溶解液中加入P3000，室温孵育10分钟，滴入已经换成Opti-MEM的平皿中，转染5小时后，换成正常细胞培养液，24小时后进行相应实验。

1.4 CCK8检测结肠癌细胞存活率

细胞生长至对数生长期后，进行细胞传代，计数，铺96孔板，按照每孔5000个细胞进行铺板，铺板后过夜等待细胞完全贴壁后进行不同分组作用。按照不同的分组作用细胞，观察细胞状态完成相应的作用，待作用时间完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，轻轻混匀，放入浮箱内继续培养3小时后停止作用，利用酶标仪检测吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting检测结肠癌细胞内蛋白表达

蛋白是细胞内发挥生物学功能的大分子物质，检测蛋白水平的改变可以反应细胞内一些现象的发生，细胞蛋白提取和表达检测步骤如下，将对数生长期的细胞按照分组进行分皿，待细胞完全贴壁后进行相应的处理，处理完成后进行蛋白的提取，弃除细胞正常培养液，冷却的PBS洗细胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA细胞裂解液，均匀铺开后，放置冰上作用5分钟后，利用细胞刮将细胞完全刮除后转至EP管中，放入4℃冰箱摇匀作用30分钟，3 000 rpm/min离心20 min，取上清后对蛋白浓度进行定量(BCA方法)。根据蛋白浓度绝对上样体积，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其变性后，进行蛋白质丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量的蛋白，将胶上的蛋白通过转模转移至PVDF膜上， 5%脱脂奶粉中封闭2小时，根据检测蛋白的不同加入相应的一抗，低温孵育过夜，第二天PBST清膜3次后加入相应的二抗，室温孵育2小时后， PBST清膜3次， ECL发光显示，对结果进行拍照分析。

1.6 流式细胞仪检测不同分组结肠癌细胞凋亡率

利用流式细胞术检测不同分组下结肠癌细胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI双染色检测凋亡率的改变。具体步骤如下，将对数生长期的细胞按照分组进行分皿，待细胞完全贴壁后进行相应的处理，药物作用完成后，消化收集细胞，利用冷PBS清洗细胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用半个小时，利用流式细胞术进行荧光强度的检测。

1.7 统计学方法

利用SPSS 16.0统计学软件进行分析，两组比较采用t检验的方法，三组及三组以上采用方差分析的方法，P<0.05定义为具有统计学意义。

2 结果

2.1 人正常结肠上皮细胞与结肠癌细胞miR-155表达水平

为明确miR-155在人正常结肠上皮细胞(NCM460)和结肠癌细胞(SW480，HCT-116，HT-29)中表达的差异，我们首先利用了RT-qPCR的方法检测了细胞中miR-155表达水平，结果显示，与正常结肠上皮细胞相比，不同种类的结肠癌细胞都呈现出了miR-155表达水平的升高，差异具有统计学意义，见表1。

2.2 miR-155 inhibitor对结肠癌细胞存活率的影响

在检测到miR-155表达水平上调的基础上，我们进一步探讨抑制miR-155对结肠癌细胞生物学行为的影响，我们首先检测了SW480细胞存活率的改变，结果发现，转染miR-155抑制剂可以明显的降低SW480细胞存活率，差异具有统计学意义，见表2。

表1 RT-qPCR检测不同细胞系中miR-155表达水平

*与NCM-460相比较有统计学差异，P<0.05

表2 miR-155 inhibitor对SW480细胞存活率的影响

*与Control组比较，P<0.05

2.3 miR-155 inhibitor对结肠癌细胞凋亡的影响

在检测miR-155 inhibitor对结肠癌细胞存活率影响的基础上，我们进一步检测了其对凋亡率的影响，我们首先利用流式细胞术的方法检测了给予miR-155 inhibitor对凋亡率的影响，结果发现，与对照组相比较，miR-155 inhibitor可以明显的增加结肠癌细胞的凋亡率，差异具有统计学意义，结果见表3。为明确细胞中凋亡的改变，我们利用Western Blotting的方法进一步检测了结肠癌细胞中凋亡相关蛋白的表达水平，结果发现，给予miR-155 inhibitor可以明显的增加细胞中cleaved caspase-3表达，结果见图1。

表3 miR-155 inhibitor对SW480细胞凋亡率的影响

*与Control组比较，P<0.05

图1 miR-155 inhibitor对SW480细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

2.4 miR-155 inhibitor对结肠癌细胞自噬的影响

研究显示，自噬在mircroRNA与肿瘤之间的关系中发挥着重要的作用，因此我们进一步检测了自噬相关蛋白的改变。Western Blotting结果发现，给予miR-155 inhibitor可以明显的增加细胞中自噬相关蛋白LC3-II表达，结果见图2。

图2 miR-155 inhibitor对SW480细胞LC3蛋白表达水平的影响

2.5 抑制自噬对miR-155 inhibitor引起的结肠癌细胞死亡的影响

为明确自噬在miR-155 inhibitor引起的结肠癌细胞死亡中的作用，我们给予细胞自噬抑制剂3-MA，结果发现，抑制自噬可以进一步增加miR-155 inhibitor引起的细胞存活率的下降，差异具有统计学意义，结果见表4。

表4 抑制自噬对miR-155 inhibitor引起的 结肠癌细胞死亡的影响

*与Control组比较，P<0.05；#与miR-155 inhibitor组，P<0.05

2.6 抑制自噬对miR-155 inhibitor引起的结肠癌细胞凋亡的影响

我们进一步检测了抑制自噬对miR-155 inhibitor引起的结肠癌细胞凋亡的影响，Western Blotting结果发现，抑制自噬可以进一步增加miR-155 inhibitor引起的cleaved caspase-3表达的增加，结果见图3。

图3 抑制自噬对miR-155 inhibitor引起的结肠癌细胞凋亡的影响

3 讨论

结直肠癌是发达国家和发展中国家都非常常见的一种恶性消化系统肿瘤[9]。由于对结肠癌发病机制和分子调控认识的局限性，导致了目前治疗效果的不佳[10]。因此，如何深入的了解结肠癌的发生发展的过程，明确其分子调控机制，寻找新的有效的分子治疗的靶点成为结肠癌研究的热点和难点。越来越多的证据表明小分子RNA(miRNAs)在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用，其通过靶向调节与肿瘤发生发展相关的基因的表达，参与肿瘤的调控[11]。研究显示，miR-155在多种癌症中都呈现出了高表达，其促进了多种肿瘤的发生和发展；同时，在肿瘤的诊断和预后中也发挥了重要的作用[12]。但是，miR-155与结肠癌发生发展之间的关系报道较少，其对结肠癌细胞生物学行为的调控还不是很清楚。

我们首先检测了正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞中miR-155表达水平，发现不同结肠癌细胞中都呈现出了明显的miR-155表达水平的升高。我们进一步检测了其对细胞存活和凋亡的影响，结果发现，抑制miR-155可以引起结肠癌细胞存活率的下降和凋亡率的上升。提示出，miR-155参与了结肠癌细胞生物学行为的调控。

自体吞噬是细胞内普遍的过程，通过自噬体和溶酶体的融合清除不必要的细胞内氨基酸、脂肪酸和核苷酸。多种不利的条件都可以导致自噬的发生，包括营养缺乏，缺氧，DNA损伤，或活性氧(ROS)的产生，通过自噬过程，降解不需要的细胞器以及蛋白质，脂肪酸等物质，从而维持细胞内稳态和生存[13]。自噬在肿瘤的发生发展中起着双重作用。在肿瘤发生的早期阶段，它具有很强的抑制肿瘤发生的作用。通过抑制组织损伤，炎症和基因组不稳定来防止肿瘤的发生[14]。相比之下,一旦肿瘤在生长，自噬促进其生长、代谢，因为它能让癌细胞克服细胞内和环境压力[15]。

为明确miR-155对结肠癌细胞自噬的影响以及自噬在miR-155 inhibitor引起细胞毒性中的作用，我们展开了进一步研究。结果发现，miR-155 inhibitor可以促进结肠癌细胞自噬的发生，抑制自噬可以明显的增加miR-155 inhibitor引起的细胞存活率的下降和凋亡的升高，提示自噬在miR-155 inhibitor诱导细胞毒性中起保护作用。

综上所述，miR-155在结肠癌细胞中呈现高表达，抑制miR-155可以引起结肠癌细胞存活率的下降和凋亡的升高，联合自噬抑制剂可以进一步增加细胞毒性。本课题为临床治疗结肠癌提供了新的靶点和联合用药策略。