二甲双胍提高肝癌细胞的药物敏感性及其作用机制

王亚东,周 军,孙学军,尹家俊*

(1.大连大学附属中山医院 a.普通外科;b.介入科,辽宁 大连116001；2.西安交通大学附属第一医院 普通外科)

原发性肝癌是世界上最常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一,5年生存率约为17%,而晚期恶性肿瘤患者的生存率仅为3%[1-2]。手术切除是肝癌治疗的首选方法,但由于肝癌早期症状不明显导致大部分患者确诊时已是晚期,错失了最佳的手术时机,因此化学疗法仍是中晚期肝癌患者治疗的重要方法。索拉非尼是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂,也是原发性肝癌临床管理的一线药物,然而肿瘤细胞耐药性的出现及发展严重影响了肝癌的治疗效果[3]。

近年来,不断有研究表明,二甲双胍,一种双胍类口服治疗2型糖尿病的临床药物,在增强肿瘤细胞化疗敏感性方面发挥着重要性作用[4，5]。但是其在肝癌细胞化疗敏感性方面的作用及相关机制依然未全部阐明。因此,本研究探究了二甲双胍在肝癌细胞索拉菲尼敏感性方面的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 细胞培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素/链霉素试剂及胰蛋白酶均购自美国Gibco；凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)购自上海翊圣生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学；实验所用一抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司,二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二甲双胍购自大连美仑生物制药有限公司,索拉菲尼由大连大学附属中山医院提供。

1.1.2细胞 人肝细胞癌细胞系HepG2购自中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 HepG2细胞培养于含10%FBS及1%青霉素/链霉素的MEM培养基中,并将其置于37℃,CO2含量为5%的细胞培养箱中培养,待细胞融合度达到80%-90%时消化细胞进行传代。

1.2.2药物处理 给予HepG2细胞0,1,5,10,50 μM的索拉菲尼分别处理0、24、48和72 h。此外,0,1,2,5,10 mM的二甲双胍处理细胞0、24、48和72 h。

1.2.3蛋白免疫印迹(Western blot) 细胞收集或组织匀浆后加入蛋白裂解液,离心吸取上清为组织全蛋白溶液,BCA 法测定蛋白质含量,变性后取30 μg蛋白样本经10% SDS-PAGE胶进行分离,转膜后将PVDF膜用5%牛奶进行室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育1 h,洗膜后ECL化学荧光显色,ImageJ软件进行定量。 GAPDH为内对照。

1.2.4CCK-8实验 HepG2细胞按照4000个/孔的密度接种于96孔培养板中,培养过夜,第二天给予细胞不同药物浓度的索拉菲尼、二甲双胍或索拉菲尼+二甲双胍处理,于处理后的0、24、48和72 h分别向每孔中加入10 μl CCK-8溶液和90 μl细胞培养基继续孵育 4 h,测定450 nm 波长处的吸光度。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞转染后48 h用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化细胞,清洗一次,离心后每组加入 1×Annexin V Binding Buffer 100 μl,充分混匀细胞,每组细胞加入 5 μl FITC Annexin V 染液,5 μl PI 染液,避光室温反应15 min,然后每管加300 μl 1×Annexin V Binding Buffer溶液,1 h流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 二甲双胍增强索拉菲尼对HepG2细胞增殖的抑制作用CCK-8实验显示,随着药物浓度的增强及作用时间的延长,索拉菲尼对HepG2细胞增殖活性的抑制作用明显提高(图1A)；同样地,5 mM及以上浓度的二甲双胍亦可抑制HepG2细胞的增殖活性(图1B)。由以上结果,我们最终选取了5 μM的索拉菲尼和5 mM的二甲双胍做接下来的研究。同索拉菲尼组相比,二甲双胍+索拉菲尼组细胞的增殖活性明显降低(图1C)。

A-B.CCK-8检测不同浓度二甲双胍或索拉菲尼对HepG2细胞增殖活性的影响(*P<0.05,**P<0.01)；C.CCK-8检测对照组、索拉菲尼(5 μM)组及索拉菲尼(5 μM) + 二甲双胍(5 mM)组HepG2细胞的增殖活性(*P<0.05,索拉菲尼组vs对照组；#P<0.05,索拉菲尼+二甲双胍组vs索拉菲尼组)。

图1 二甲双胍增强索拉菲尼对HepG2细胞增殖的抑制作用

2.2 二甲双胍增强索拉菲尼对HepG2细胞的促凋亡作用药物处理48 h后收集细胞,流式细胞术结果显示,同索拉菲尼组相比,二甲双胍+索拉菲尼组细胞凋亡明显升高(图2A)；此外,western blot结果显示,二甲双胍+索拉菲尼组Bcl-2表达降低,而caspase3和Bax表达升高(图2B)。

2.3 二甲双胍抑制HepG2细胞的上皮间充质转化Western blot结果显示,同索拉菲尼组相比,二甲双胍+索拉菲尼组细胞中E-cadherin表达升高,而N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表达降低(图3),表明二甲双胍可抑制HepG2细胞的上皮间充质转化。

2.4 二甲双胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活同索拉菲尼组相比,二甲双胍+索拉菲尼组细胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化蛋白的表达降低(p-PI3K、p-AKT、p-mTOR),而总蛋白表达水平不变(图4)。

A.流式细胞术检测各对照组、索拉菲尼组及索拉菲尼+二甲双胍组HepG2细胞的凋亡情况；B.Western blot检测各处理组HepG2细胞中Bcl-2、Bax及caspase3蛋白的表达情况。(*P<0.05,索拉菲尼组vs对照组；#P<0.05,索拉菲尼+二甲双胍组vs索拉菲尼组)

图2二甲双胍增强索拉菲尼对HepG2细胞的促凋亡作用。

Western blot检测各处理组HepG2细胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白的表达(*P<0.05,索拉菲尼组vs对照组；#P<0.05,索拉菲尼+二甲双胍组vs索拉菲尼组)。

图3 二甲双胍抑制HepG2细胞的上皮间充质转化

Western blot检测各处理组HepG2细胞中PI3K、AKT、mTOR总蛋白及磷酸化蛋白的表达(*P<0.05,索拉菲尼组vs对照组；#P<0.05,索拉菲尼+二甲双胍组vs索拉菲尼组)。

图4 二甲双胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活。

3 讨论

二甲双胍作为2型糖尿病的一线治疗药物,除了具有胰岛素增敏、降血压等作用,近年来研究表明其可以降低糖尿患者罹患肝癌的风险并改善肝癌患者的预后[6]。二甲双胍亦可明显抑制肝癌细胞的增殖活性并促进其凋亡[7-9]。此外,越来越多的证据表明二甲双胍可提高肿瘤细胞的化疗敏感性。例如,吴诗文等[10]研究表明,在胃癌中,采用二甲双胍联合顺铂处理较单一顺铂处理细胞增殖活性受到明显抑制。Uehara[11]实验结果显示,二甲双胍能明显抑制子宫内膜癌细胞增殖并提高其对顺铂的化疗敏感性。同样地,在下咽癌[12]、结肠癌[13]、胰腺癌[14]等恶性肿瘤中,二甲双胍联合化疗药物用药亦可明显增强肿瘤细胞的化疗敏感性。在本研究中,我们通过体外实验探究了二甲双胍对肝癌细胞HepG2化疗敏感性的影响,我们发现,同索拉菲尼单独处理组相比,二甲双胍联合索拉菲尼用药可促进促凋亡蛋白Bcl-2和caspase3的表达,降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进细胞凋亡且抑制细胞增殖活性,以上结果揭示了二甲双胍同样可增强肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。

为了探究二甲双胍诱导化疗敏感性的相关机制,我们通过western blot技术检测了二甲双胍对上皮间充质进程的影响,我们发现二甲双胍处理可明显降低N-cadherin、Snail及Vimentin等间充质细胞的标记分子,而提高上皮细胞标记分子E-cadherin的表达,表明二甲双胍可干预肝癌细胞的上皮间充质转化进程。此外,我们亦探究了二甲双胍对PI3K/AKT/mTOR通路激活的影响,结果显示二甲双胍处理后HepG2细胞中p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表达水平均显著降低,而总蛋白无明显变化,表明二甲双胍可抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活,这或许介导了二甲双胍对肝癌细胞化疗敏感性的提高。二甲双胍是能量调控信号分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的激动剂,激活AMPK可抑制下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达,进而调控细胞的增殖与凋亡等生命进程。激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路可通过提高促癌基因缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)、cyclin D及c-myc等的转录和翻译促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡,因此,特异性调节PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活已成为癌症治疗的重要靶标[15]。

综上,本研究表明二甲双胍能够明显增强肝癌细胞对索拉菲尼的药物敏感性,促进细胞凋亡并抑制细胞增殖活性,这可能与PI3K/AKT/mTOR通路和上皮间充质转化进程的抑制相关。