不同时间点枸杞多糖灌胃处理对大鼠双侧海绵体神经缺损后腓肠神经移植的修复效应

乐进 李和程

(1西安医学院第一附属医院泌尿外科，陕西 西安 710061；2西安交大第二附属医院泌尿外科)

阴茎勃起是一个靠完整神经反射弧支配的生理过程，如果由于各种原因导致与勃起有关的中枢、外周神经损伤即会导致勃起功能障碍(ED)，即神经源性(N)ED。据预测到2025年男性中的1/3将患有不同程度的ED〔1〕，NED是其主要原因〔2〕。研究证实枸杞多糖(LBP)对中枢神经有保护作用，有学者〔3〕在离体实验中观察到LBP对体外培养的视网膜神经细胞的生长有保护作用，有学者在高眼压动物模型中发现LBP对视网膜神经细胞有保护作用〔4〕，而关于LBP对外周神经作用的报道较少。本文旨在进一步研究LBP对大鼠双侧海绵体神经缺损后腓肠神经移植效果。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：SD 雄性大鼠28只，SPF 级，3～4月龄，体重 260～300 g，购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2015-0004。于上海大学动物实验中心 SPF 环境中饲养，自由进水、进食。所有大鼠经性交实验证实均有正常的性功能。主要试剂：LBP购自上海大学医学院；0.2%TritonX-100 购自美国 Amresco 公司；甲苯胺蓝、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)购自美国 Sigma 公司；戊巴比妥钠购自德国 MERCK 公司；甲醛、苦味酸、蔗糖、碘伏消毒液购自国药集团化学有限公司；聚乙二醇及聚乙烯醇混和物(OTC)购自Tissue-Tek 公司；锇酸购自上海刘氏科技医药有限公司；乙醇购自云兴化工有限公司；低分子肝素钠购自深圳市天道医药有限公司。

1.2实验动物分组 术前将28只SD雄性大鼠随机分成4组各7只，即双侧海绵体神经切断后自体腓肠神经移植术后第1天开始LBP(10 mg/kg)灌胃持续2 w组(A组)、双侧海绵体神经切断后自体腓肠神经移植术后第1周开始LBP(10 mg/kg)灌胃持续2 w组(B组)、双侧海绵体神经切断后自体腓肠神经移植术后第1天开始等量生理盐水灌胃持续2 w 组(C组)、假手术组(仅分离但不损伤双侧海绵体神经)。

1.3建立动物模型 在无菌条件下，各组SD雄性大鼠用1%的戊巴比妥(50 mg/kg)溶液经2 ml无菌注射器行腹腔注射。待大鼠麻醉成功后，于下腹部备皮，将大鼠四肢呈仰卧位固定于木板上，术区用碘伏溶液消毒，铺巾，取下腹部正中至阴茎根部切口。在放大10倍的手术显微镜(上海医用仪器厂，SXP-1B型)下，于两侧前列腺背外侧方找到海绵体神经和盆神经节。假手术组在找到海绵体神经和盆神经节后，仔细游离双侧海绵体神经，后逐层关腹，缝合伤口。腓肠神经移植并灌胃组均暂时关闭腹腔，于左侧外踝后方取腓肠神经，长约20 mm，平均分成两段，然后将腓肠神经置于无菌生理盐水中，后缝合外踝伤口。打开腹腔，找到海绵体神经后游离并切断双侧海绵体神经约5 mm，在手术显微镜下将腓肠神经用10-0的无损伤线无张力端吻合于双侧海绵体神经的缺损处，缝合时神经切勿牵拉，吻合部位打结不宜过紧，移植段不能扭曲，移植完毕后逐层关腹。对行神经移植的SD大鼠分别于术后第1天、第1周开始给予LBP(10 mg/kg)灌胃及术后第1天开始等量的生理盐水灌胃，均持续2 w。造模完成后常规饲养3个月。

1.4阴茎海绵体内压(ICP)的测定 用纹式钳将阴茎体分离出来，然后用组织钳轻轻钳夹阴茎体，用纹式钳仔细分离阴茎根部，从阴茎脚处切断坐骨海绵体肌，暴露阴茎海绵体白膜。设置刺激参数为20 Hz、5.000 V、5.00 ms脉冲，电流持续刺激50 s并记录ICP值。

1.5海绵体神经的甲苯胺蓝染色 找到双侧移植神经干，取离移植神经干远端2 mm、海绵体神经干约6 mm。在显微镜下通过油镜(×1 000倍)观察1%的甲苯胺蓝染色后整个横切面轴突的个数。

1.6阴茎海绵体组织NADPH染色后检测一氧化氮合酶(NOS)阳性神经纤维的数目 用CM1900恒冷箱式冰冻切片机(Leica德国)切片,片厚约10 μm。将切片放置于含有5 mg/ml的NBT、1 mg/ml NADPH、0.2%TritonX-100的0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液(pH8.0)中3 h，温度37℃。用冰PBS溶液冲洗终止反应。显微镜放大400倍下观察阴茎海绵体组织NADPH染色后NOS阳性神经纤维的数目。

1.7统计学分析 采用SPSS11.5软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1大鼠海绵体神经缺损腓肠神经移植术后3个月镜下改变 如图1所示，显微镜下可见移植神经生长良好，有光泽，色灰白，吻合端无离断，神经无水肿及坏死情况。

2.2各组ICP测定结果 A组ICP明显低于假手术组(P<0.05)，但显著高于C组(P<0.05)；B组ICP显著低于假手术组(P<0.05)，显著高于C组和A组(P<0.05)。见表1。

图1 术后3个月移植后的腓肠神经(×10)

2.3各组海绵体神经轴突数目比较 A组轴突数明显低于假手术组(P<0.05)，但显著高于C组(P<0.05)；B组轴突数显著低于假手术组(P<0.05)，显著高于C组和A组(P<0.05)。见表1、图2。

2.4各组阴茎海绵体NOS阳性神经纤维数目比较 A组显著低于假手术组(P<0.05)，但显著高于C组(P<0.05)；B组显著低于假手术组(P<0.05)，但显著高于C组和A组(P<0.05)。见表1、图3。

表1 各组ICP测定结果

与假手术组相比：1)P<0.05；与C组相比：2)P<0.05；与A组相比：3)P<0.05

图2 各组海绵体神经轴突(甲苯胺蓝染色，×1 000)

图3 各组阴茎海绵体NOS阳性神经纤维(NADPH染色，×400)

3 讨 论

阴茎勃起是以海绵体充血肿大为特点的神经血管事件，其过程依赖于神经和体液机制的整合及不同级别神经系统的参与。它要求自主性和躯体神经的参与及整合众多的脊髓和脊髓上的神经冲动〔5〕。阴茎的勃起是通过肾上腺素能神经末梢释放神经递质，去甲肾上腺素等从而激活肾上腺素能受体(尤其是在阴茎小梁肌高表达的α-1肾上腺素受体)来完成的。肾上腺素能受体兴奋后能引起阴茎动脉血管平滑肌收缩及阴茎小梁平滑肌收缩，从而导致动脉血流量减少及海绵窦腔隙空间的塌陷，最终导致静脉充血。内皮素-1是由血管内皮细胞或可能是由小梁平滑肌细胞本身合成的一种强力血管收缩肽，被认为参与了人体海绵体组织的收缩调控。目前已知其他类物质亦参与调控阴茎海绵体的充血肿大：几种由海绵体组织产生的缩肌类前列腺素(PG)H2、PGF2、血栓素(TX)A2，它们和一氧化氮(NO)同时释放，从而减轻了NO的扩血管效应；血管紧张素(AT)Ⅱ可能是通过激活AT-Ⅰ型受体而导致阴茎海绵体的收缩效应〔6〕。针对平滑肌细胞的各种特定信号机制将会导致细胞内游离钙离子浓度增加，从而直接通过Rho-激酶的激活来激活肌球蛋白，最终导致阴茎平滑肌被激活。在阴茎勃起过程中的第一步就是血管扩张，其直接后果就是导致海绵体内血流量的增加及海绵窦内压力的增加。平滑肌细胞的舒张依赖于内分泌(循环物质)、旁分泌(释放的递质来源于内皮细胞和邻近神经)，也有可能是自分泌(由平滑肌细胞自身合成的物质)。阴茎动脉扩张主要是NO和内皮源性超极化因子(EDHF)起作用，后者主要是通过开放钾离子通道起到舒张血管的作用〔7〕。NO是一种高活性的自由基，主要由NOS使用L-精氨酸和分子氧来合成。迷走神经由于可释放NO和乙酰胆碱所以被称为氮能神经。

NO的释放可能是通过节后胆碱能神经激活了内皮细胞，或者循环血浆物质如氧或缓激肽的刺激，或更可能的是在勃起过程中由血管及海绵窦扩张过程中产生的切应力导致。一旦产生，NO便扩散到邻近血管内皮细胞的平滑肌细胞，并和其结合，从而激活鸟苷酸环化酶。此酶催化三磷酸乌苷(GTP)的去磷酸化从而产生去磷酸化的环磷酸鸟苷(cGMP)，cGMP作为第二信使参与了许多重要的细胞功能，特别是产生舒张平滑肌的效应〔8〕。

阴茎接收骶髓副交感神经(骨盆)、胸腰交感神经(下腹和腰椎)和体(阴部)的神经支配。阴茎主要的兴奋性传入神经由副交感神经系统负责，主要是负责阴茎血管的舒张和勃起。节前纤维起源于骶部脊髓(S2-S4)，通过盆腔神经丛到达盆腔。海绵体神经含有副交感神经纤维，是阴茎血管平滑肌传入神经。阴茎的交感神经节前神经纤维是位于第10胸椎至第2腰椎脊髓节段的神经元。这些纤维在交感神经的脊柱椎旁链的神经节的突触后连接，达到肠系膜和腹下神经丛;产生的腹下神经到达盆腔神经丛，因此泌尿生殖区的交感神经传出神经主要是由盆神经和阴部神经合成。交感神经系统似乎在抑制阴茎勃起方面发挥了举足轻重的作用〔9〕。

除了自主神经支配，阴茎也接受躯体传入神经来自阴茎背侧神经(DPN)——阴部神经的感觉支的支配。阴茎的龟头感觉神经支配是独一无二的，因其近90%的传入终端是游离神经末梢。来自阴茎皮肤、包皮及龟头的传入性刺激，由阴茎背侧神经开始传递，并维持促反射性的勃起。接受由触觉、视觉、幻想和嗅觉的刺激可导致男性勃起，而且该反应是由脊髓中心控制的。这可能是神经反射和心理刺激骶髓副交感神经通路的协调作用〔10〕。目前在脊髓节段以上因素对勃起功能所起的作用知之甚少，而且以往的所有研究基本上是在动物模型的基础上。下丘脑及大脑边缘区通路似乎在勃起中发挥了一定作用，尤其是下丘脑内侧视前区(MPOA)在勃起调节以外的一些自主性反应如心率增快和皮肤潮红等性反应起到了协同作用。其他的脊髓中心(即背内侧和腹内侧核、下丘脑室旁核、脑桥、延髓中缝、蓝斑和导水管周围灰质)及它们的连接边缘和皮质区也参与到勃起的过程中〔11〕。

本文采用大鼠的腓肠神经作为移植神经干主要是因为腓肠神经方便取材，术后损伤较小，术区的麻木及感觉减退并不影响大鼠正常的行走及活动。本研究说明用腓肠神经移植替代受损的海绵体神经后其神经反射通路是完整的，而LBP的应用促进了其神经发射通路的恢复。由此可见，LBP灌胃对海绵体神经损伤有修复作用，神经因受到机械损伤后，神经膜表面的微血管网受到破坏，缺血再灌注随后出现，加之血凝块及炎症的产生，局部产生大量的自由基〔12,13〕。自由基在体内聚集从而造成脂质过氧化反应使机体的各种组织受到损伤，特别是神经组织的损伤〔14〕，从而影响其再生和功能恢复。在术后第1天大鼠神经离断吻合后可能是由于创伤，出血致使氧化应激增强，自由基产生较多，且神经离断后会导致神经元的外漏，而LBP本身有调节免疫的功能，相对抑制了LBP的抗氧化作用，而在术后第1周大鼠神经创伤较前恢复，吻合端神经元外漏减少，氧化应激反应相对较弱，自由基产生相对较少，从而发挥了LBP增强免疫及抗氧化功能，促进神经恢复，具体的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。