p62和Ki-67在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义

程新宇 周成美 孙洁 王翠芳

(1沈阳医学院附属中心医院病理科，辽宁 沈阳 110024；2锦州医科大学)

自噬相关蛋白p62由C-Myc编码，是在细胞质中合成、定位于细胞核的一种多功能泛素化结合蛋白〔1〕，具有选择性自噬功能，可在一定程度上反映自噬活性〔2〕。近年来随着研究的不断深入，研究者发现p62参与了包括自噬在内的众多生命活动信号通路〔3〕，其表达和调控异常与多种恶性肿瘤密切相关〔4〕；增殖指数(Ki-67)是细胞增殖的重要标志，常可作为预测恶性肿瘤发展及预后的指标。本文主要探讨p62和Ki-67表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征的关系，为乳腺癌治疗及预后提供新的研究靶点。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取2015年1月至2017年12月沈阳医学院附属中心医院病理科79例乳腺浸润性导管癌标本为实验组，20例相应距肿瘤组织5 cm以上的癌旁正常乳腺组织标本为对照组，所有患者临床病理资料存档完整。患者年龄30～78岁，中位年龄58岁；肿瘤直径<2 cm 16例，≥2 cm 63例；组织学分级Ⅰ级2例，Ⅱ级54例，Ⅲ级23例；有淋巴结转移33例，无淋巴结转移46例。患者行免疫组织化学检测时均未行放化疗。

1.2主要试剂 通用型p62鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人单克隆抗体、链霉菌抗生素-过氧化物酶连接法(SP)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3SP法免疫组织化学染色 乳腺浸润性导管癌患者肿物切除后均使用10%中性甲醛固定，依据病理规定规范取材，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规石蜡脱水，柠檬酸抗原修复(pH6.0)、高压修复，室温冷却30 min；用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3次，每次3 min，用油笔圈定玻片上的待测组织区域；每张切片滴加过氧化酶阻断试剂3%H2O2(试剂A)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，每次3 min；每张切片滴加非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10 min；除去血清，每张切片滴加第一抗体p62(稀释比1∶200)或Ki-67 4℃冰箱冷藏过夜；PBS冲洗3次，每次3 min，每张切片加生物素标记的第二抗体(试剂C)室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；每张切片滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；每张切片滴加新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10 min。自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封固。使用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性乳腺癌标本切片作阳性对照。

1.4结果判读 免疫组化切片均由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法单独判读。(1)p62 阳性结果判读标准：p62阳性表达为出现棕黄色颗粒，并定位于细胞质。(2)Ki-67阳性判断标准：阳性表达定位于细胞核。在高倍镜下任意计数5个视野，每次选取200个细胞进行观察，按阳性细胞所占百分比计分，评分标准〔5〕:0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞<10%；2分为阳性细胞10%～30%；3分为阳性细胞>30%。按染色强度计分：不着色为0分；淡黄色计1分；黄色计2分；棕黄色计3分。阳性细胞百分比计分与染色强度计分的乘积:0～2分为阴性，3～9分为阳性。

1.5统计学处理 应用SPSS17.0软件行χ2检验，关联性分析采用Spearman 等级相关分析。

2 结 果

2.1p62和Ki-67在乳腺组织中表达 实验组p62阳性表达率为58.2%(46/79)，明显高于对照组10.0%(2/20；χ2=6.532,P=0.011)；Ki-67阳性表达率为51.9%(41/79)，明显高于对照组5.0%(1/20；χ2=7.389,P=0.007)。见图1。

2.2p62和Ki-67表达与临床病理特征的关系 实验组中，p62和Ki-67阳性率均与组织学分级相关，且组织学分级越高，两者阳性率越高；p62阳性率与淋巴结转移相关。见表1。

p62阳性

p62阴性

Ki-67 阳性

Ki-67阴性

临床病理特征n p62+ -χ2值P值Ki-67+-χ2值P值年龄(岁) ≤605131 200.3870.53430212.7640.096 >602815 131117淋巴结转移 是332679.8470.00217160.0030.954 否4620262422肿瘤直径 <2 cm16791.7290.189970.1520.696 ≥2 cm633924 3231组织学分级 Ⅰ、Ⅱ级5628285.3540.021193724.882 0.000 Ⅲ级23185 221

2.3p62和Ki-67相关性分析 p62和Ki-67共同阳性表达30例，共同阴性表达22例；p62阴性表达而Ki-67阳性表达11例；p62阳性表达而Ki-67阴性表达16例。p62和ki-67表达呈正相关(r=0.315,P=0.005)。

3 讨 论

乳腺浸润性导管癌是乳腺癌中最常见且恶性程度较高的一种病理类型，发病率呈逐年上升趋势。自噬是细胞在生理状态下适应环境的一种保护机制，自噬异常参与了肿瘤的发生、发展等病理过程〔6〕。自噬相关蛋白p62是一种支架蛋白。自噬发生时，p62首先与细胞质中泛素化蛋白结合，再与定位于自噬体内膜上的微管相关蛋白轻链3(LC3B)形成复合物，被自噬溶酶体降解；自噬过程中，p62蛋白在细胞质中不断被降解，自噬被抑制时，p62蛋白在细胞质中不断积累，因此p62可作为反映自噬活性的标记蛋白。雷程等〔7〕研究表明，p62蛋白在结肠癌组织细胞质中阳性表达明显高于癌旁正常组织，p62高表达提示自噬活动减弱，促进肿瘤发展；刘婷婷等〔8〕研究发现p62在外阴鳞状细胞癌的细胞质中表达明显高于外阴的正常皮肤，说明外阴鳞状细胞癌自噬活动减弱促进了癌的发生，与本实验结果一致。p62异常聚集表明乳腺浸润性导管癌自噬活性显著减弱，自身受损、变性或衰老细胞器和大分子物质得不到及时降解，导致活性氧大量产生，使乳腺正常组织DNA损伤，促使正常乳腺组织向乳腺浸润性导管癌进一步转化。

以往研究提示细胞内p62异常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信号，反向调节自噬，起到促癌作用〔9〕；近年来发现细胞内p62异常聚集还可以激活核因子(NF)-κB和核因子相关因子(Nrf)2两个系统〔10〕。p62蛋白通过T6BD与肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6相互作用促进TRAF6寡聚化，从而导致TRAF6多聚泛素化及NF-κB〔11〕活化。NF-κB是一个转录因子蛋白家族，涉及细胞存活及分化，NF-κB信号途径激活对于肿瘤细胞增殖及转移非常重要；Nrf2是细胞内最重要的抗氧化应激调控通路因子，可稳定细胞内环境〔12〕。当氧化应激持续存在时，p62与Nrf2竞争结合肿瘤抑制因子(Keap)1，使Nrf2入核，从而激活Nrf2靶基因转录，保护肿瘤细胞免受氧化性损伤，使癌细胞生存能力增强。本实验结果显示，p62表达与肿瘤的恶性行为相关，其高表达预示恶性程度高，易发生转移，是预后差的指标。Burdelski等〔13〕使用免疫组化技术检测了前列腺癌组织中p62的表达，发现其表达与组织学分级及淋巴结转移有关，其结果与本实验相似。Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，是评价恶性肿瘤细胞增殖程度最可靠的指标。在乳腺浸润性导管癌组织中Ki-67的高表达可提示肿瘤细胞增殖活跃，侵袭力强，易发生转移，预后较差。乳腺浸润性导管癌组织中p62和Ki-67表达呈显著正相关,表明两者共同促进肿瘤发生；且两者高表达预示肿瘤恶性程度高、侵袭力强，易发生转移；有希望成为判断乳腺浸润性导管癌预后的有力指标。